莱芜黑山羊卵巢FSHr、LHr的免疫组化定位研究

为从形态学角度理解内分泌调节过程,揭示促性腺激素(GTH)对雌性哺乳动物卵巢调节作用机制,对处于非繁殖季节的莱芜黑山羊卵巢中FSHr、LHr分布进行免疫组化SABC方法定位.分别选取相邻的6张连续阳性切片,光镜观察、图像分析.结果显示:FSHr、LHr阳性细胞主要分布于卵泡颗粒细胞、膜细胞、卵母细胞、血管周围间质,尤其以在卵泡颗粒细胞、膜细胞的胞质中分布最多.原始卵泡卵母细胞中便有两种受体阳性物质分布,在各级卵泡中两种受体阳性细胞数量、染色强度随卵泡发育水平呈正向增加趋势.

绵羊LHR基因PCR-SSCP多态性与繁殖性状的关联分析

通过聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析方法检测绵羊品种(湖羊、晋中绵羊和陵川半细毛羊)促黄体素受体(luteinizing hormone receptor,LHR)基因外显子11核酸序列的单核苷酸多态性,并研究该基因多态性对湖羊性早熟和产羔数的影响。结果表明:在6对引物扩增产物中,只有引物P2和P6的扩增片段具有多态性,引物P2扩增区存在2种基因型,分别为LL和LM型,在3个绵羊品种中均未检测到MM型;引物P6扩增区存在6种不同的SSCP带型,经序列比对分析存在T2053A、A2044T和G2003A的错义突变。湖羊和晋中绵羊P2扩增区基因型分布差异不显著(P>0.05),而与陵川半细毛羊均存在极显著差异(P<0.01);P6扩增区的2 053、2 044、2 003位点各基因型分布在湖羊和晋中绵羊间差异不显著(P>0.05),而与陵川半细毛羊间存在显著差异。P2扩增位点仅陵川半细毛羊的基因分布不符合哈迪-温伯格定律;P6扩增区湖羊和晋中绵羊在各突变位点的等位基因频率处于群体平衡状态,陵川半细毛羊除2 003突变位点基因分布处于群体不平衡状态外,其余突变位点的等位基因频率分布符合哈迪-温伯格定律;LHR外显子11区不同基因型湖羊各胎次产羔数差异不显著(P>0.05),表明LHR外显子11对湖羊的性早熟和高繁殖力性状没有显著影响。

子宫内膜息肉组织中FSHR和LHR的表达及意义

目的探讨卵泡刺激素受体(Follicule stimulating hormone receptor,FSHR)、黄体生成素受体(Luteinizing hormone receptor,LHR)与子宫内膜息肉发生的相关性.方法运用实时荧光定量PCR方法(Real-time Quantitative polymerase chain reaction,real-time PCR)以及免疫印迹方法(Southwestern blotting,WB)从基因水平以及蛋白水平测定2016年12月~2017年11月在我院行宫腔镜下子宫内膜息肉摘除术患者子宫内膜息肉及其旁正常子宫内膜中FSHR、LHR的表达差异.结果通过real-time PCR结果显示子宫内膜息肉组织中FSHR基因表达量0.0496(0.0431,0.0656),其旁正常子宫内膜组织中FSHR基因表达量0.0002(0.0001,0.0002),差异有统计学意义(P<0.05);子宫内膜息肉组织中LHR基因表达量(0.00012293±0.00004748),其旁正常子宫内膜组织中LHR基因表达量(0.00001931±0.00000380),差异有统计学意义(P<0.05);通过WB结果显示子宫内膜息肉组织中FSHR蛋白表达水平0.4093(0.3925,0.4789),其旁正常子宫内膜组织蛋白表达水平0.2235(0.1093,0.3285),差异有统计学意义(P<0.05);子宫内膜息肉组织中LHR蛋白表达水平0.4379(0.4062,0.4503),其旁正常子宫内膜组织蛋白表达水平0.2235(0.1093,0.3278),差异有统计学意义(P<0.05).结论 FSHR及LHR存在于人子宫内膜组织中,其在子宫内膜息肉组织中的表达高于其旁正常子宫内膜组织,得出子宫内膜息肉的发生不仅与雌激素受体及孕激素受体表达失调有关,与FSHR及LHR表达失衡亦有关.

LPS对兔下丘脑、输卵管上FSHR和LHR表达的影响

【目的】检测促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(LHR)蛋白在下丘脑、输卵管的分布,以及LPS诱导后母兔下丘脑、输卵管上FSHR和LHR的表达变化。【方法】36只雌性新西兰白兔随机分为9组(n=4),一组不注射作为0h组,LPS处理组按0.5mg/kg体重耳缘静脉注射LPS,对照组注射等量的生理盐水,在注射后0、1.5、3、6和12h后处死,收集下丘脑和输卵管,采用荧光定量PCR和免疫组化在转录水平和蛋白水平分析FSHR和LHR的表达。【结果】结果显示:FSHR和LHR主要定位于输卵管黏膜层和肌层,在间质层未检测到FSHR和LHR;LPS诱导下,LPS不影响FSHR和LHR mRNA在下丘脑的转录,但下调FSHR和LHR mRNA在输卵管的表达。蛋白水平上,LPS改变了FSHR在下丘脑和LHR在输卵管黏膜层的表达模式,对LHR在下丘脑和输卵管肌层有下调作用,对FSHR在输卵管黏膜层和肌层有上调作用。【结论】LPS影响FSHR和LHR蛋白在下丘脑的表达,表明免疫-繁殖系统可以在下丘脑发生相互作用,进而影响动物生殖。

黑线仓鼠LHR部分序列的克隆与分析

以大鼠、小鼠、金仓鼠(Mesocricetus auratus)的同源保守序列设计了黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)黄体生成素受体基因(LHR)的引物,经PCR扩增得到了154 bp的目的产物,通过Blast证实该片段是黑线仓鼠的LHR序列.该段序列处于第11外显子的5’端,编码51个氨基酸,包含部分铰链区和第一个跨膜α螺旋(TM1)区.疏水性氨基酸所占比例相当高,其中缬氨酸、异亮氨酸各占9.80%,亮氨酸为19.61%,通过疏水性分析,TM1区具有典型的α螺旋特征.与大鼠、小鼠、金仓鼠等物种同源比对,核苷酸和氨基酸的同源性分别达到了83%-98%,82%-100%.α螺旋跨膜区的氨基酸同源性超过82%具有很强的保守性,但在26,41,44,48位点上仍然表现出种属之间的差异性.该研究用PCR的方法克隆出了黑线仓鼠LHR的部分序列,并对其进行了同源性分析,为今后黑线仓鼠种群繁殖机制、种群扩散模式等的研究奠定一定理论基础.

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)促性腺激素受体在雄性生殖周期中的表达

采用RT-PCR方法,研究了促性腺激素受体(FSHR和LHR)基因在雄性半滑舌鳎繁殖周期中的季节表达规律。结果表明,FSHR mRNA在雄鱼精巢、脑和脾中及LHR mRNA在雄鱼的精巢和脾中均呈季节规律性变化。3月份样品中,FSHR mRNA在精巢表达量最低,12月份,表达量最高;FSHR mRNA在脑中表达模式与精巢相反,3月份表达量最高,12月份达到最低值;FSHR mRNA在脾中表达模式和精巢相同。在6月份精巢样品中,LHR mRNA表达量最低,12月表达量最高;在脾中,LHRmRNA在3月份表达量最低,12月份表达量最高。在精巢中,FSHR mRNA和LHR mRNA都是在排精时表达量达到最大值,说明这两种受体在雄性半滑舌鳎排精时发挥重要作用。

LH受体在雌性山羊肠系膜后神经节中的分布

【目的】探讨促黄体生成素(LH)是否可以通过影响雌性山羊肠系膜后神经节(CMG)参与动物机体生殖活动的调节。【方法】取5只未怀孕健康成年雌性山羊肠系膜后神经节,于多聚甲醛中固定,经石蜡包埋并制作厚度7μm的连续石蜡切片后,采用免疫组织化学SP染色方法观察雌性山羊CMG中LH受体(LHR)的分布特点,并计算LHR免疫反应阳性细胞的相对表达量。【结果】在CMG中,神经元细胞均为LHR免疫阳性反应,多数细胞呈中等阳性,少数细胞呈强阳性,LHR免疫阳性产物主要分布在神经元的细胞膜、细胞质和细胞核膜上,但细胞核为阴性反应。神经纤维和卫星细胞中的LHR免疫阳性产物为弱阳性表达。神经元细胞上LHR的相对表达量(7.057±0.797)极显著高于其他非神经元细胞(1.497±0.690)(P<0.01)。【结论】CMG中神经元细胞是LH发挥作用的主要靶细胞,提示CMG神经元细胞中存在的LHR可能是协调LH对生殖器官的内分泌调节和自主神经对生殖器官的神经调节的中转站。

黄颡鱼促黄体激素受体基因克隆及在雌鱼繁殖周期中的表达

通过简并引物扩增及SmartTM Race技术,首次克隆了黄颡鱼促黄体激素受体(LHR)基因cDNA全长序列。该基因全长2 524 bp,编码701aa,含有属于糖蛋白激素受体(GpHR)家族的典型跨膜螺旋结构区域(TM helix)。9个富含亮氨酸的重复性序列(LRRs);4个潜在的N-端糖基化位点:29NFTC,82NVSR,203NGSR,548NLTV;24个Ser,6个Thr和5个Tyr磷酸化位点。同时400S为潜在的PKC位点。通过RT-PCR分析组织表达,卵巢繁殖周期中卵巢和脑的表达水平并结合血浆中E2含量的变化,发现LHR在卵巢中大量表达,其次是脑、肾脏、心脏、肝脏和肠存在少量或微量的表达;在卵巢繁殖周期中,卵巢LHR表达从Ⅲ期-Ⅴ期处于较高水平,Ⅴ期达到最高峰,随后下降到最低值;而脑的表达高峰出现在Ⅳ期,与血浆中E2变化相一致。推测卵巢和脑中LHR基因参与卵黄的生成,调控卵母细胞的成熟和排卵。

RNase保护法同时检测黄体生成素受体及17α－羟化酶的mRNA

睾酮是组织中主要雌激素雌二醇的前体，在卵巢内睾酮绝大部分转为雌二醇．睾酮的生成直接受垂体的黄体生成素和睾酮合成的限速酶１７α羟化酶的调控．用液相杂交的方法，同时检测了卵巢组织中黄体生成素受体和１７α－羟化酶的基因表达，并摸索出了最适条件．为今后进一步研究卵巢的功能，提供了新的手段．

注射ACTH对断奶母猪卵泡促黄体素受体表达及卵泡液中类固醇激素合成的影响

[目的]为了探讨应激对断奶母猪繁殖障碍的影响机制,本试验以促肾上腺皮质激素(ACTH)注射所致的应激模型来研究应激对断奶母猪卵泡液中类固醇激素合成及卵泡促黄体素受体表达的影响。[方法]对10头苏淮断奶母猪进行颈静脉插管手术,随机均分为对照组与ACTH处理组(n=5)。手术第3天开始以每次间隔8 h给ACTH处理组母猪注射ACTH(1 IU·kg-1),对照组母猪注射生理盐水,连续注射7 d。利用ELISA方法检测受试母猪卵泡液中类固醇激素及血浆中皮质醇的含量变化;利用荧光定量PCR测定胆固醇侧链裂解酶(CYP11A1)、17α-羟化酶(CYP17A1)、芳香化酶(CYP19A1)、类固醇激素合成急性期调节蛋白(St AR)、3β羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)、促黄体素受体(LHR)等基因的表达;利用免疫组化法检测CYP17A1、CYP19A1、LHR和3β-HSD蛋白的表达。[结果]人工注射ACTH后40%的受试母猪出现排卵障碍;其血浆中皮质醇的含量极显著升高(P<0.01);母猪卵泡液中雌二醇、雄烯二酮含量均显著下降(P<0.05);CYP17A1、CYP19A1、LHR和3β-HSD基因表达量降低,其编码的蛋白CYP17A1、CYP19A1、LHR和3β-HSD表达量也明显下降。[结论]ACTH注射所致应激过程中,受试母猪的皮质醇含量升高可导致类固醇合成酶的基因、蛋白表达量明显下降,从而影响类固醇激素的合成及卵泡的发育。类固醇激素合成降低及LHR的低表达影响断奶母猪的正常排卵。

LHR在牦牛肾和卵巢中表达情况的研究

为了探讨牦牛肾中黄体生成素受体(LHR)的表达情况,分析肾中LHR与卵巢中LHR表达的相似性,选取青海省健康的3头2岁龄雌性牦牛,根据黄牛LHR基因序列5′端和3′端的保守性设计特异性引物,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测牦牛肾和卵巢组织中LHR基因的表达量,并运用免疫组织化学法对LHR蛋白在牦牛肾和卵巢组织中表达情况进行定位研究。RT-qPCR结果显示,牦牛肾组织中LHR mRNA的相对表达量是卵巢的79.75倍。免疫组织化学结果显示,LHR在牦牛肾组织的近曲小管和远曲小管呈阳性反应,在卵巢组织中卵泡颗粒层呈明显的阳性反应;LHR在牦牛肾和卵巢中的表达量之间差异极显著(P<0.01)。结果表明,牦牛的肾组织与卵巢组织一样,均具有表达LHR的特性,提示肾可通过调节LHR参与牦牛的繁殖性能。

不同卵巢储备患者促性腺激素受体表达及影响因素分析

目的探讨不同卵巢储备女性颗粒细胞促卵泡激素受体(FSHR)、促黄体生成素受体(LHR)mRNA相对表达水平与获卵情况的关系,以及与其他促排卵治疗过程中相关指标的影响。方法收集850例患者卵泡液及颗粒细胞。纳入患者分为卵巢功能正常组(n=419)、预期低反应组(n=255)、多囊卵巢综合征(PCOS)组(n=176)。采用反转录-实时定量PCR(qRT-PCR)法测定FSHR、LHR、抗苗勒管激素(AMH)及AMHⅡ型受体(AMHRⅡ) mRNA的表达,分析以上指标在不同卵巢储备患者中表达差异及影响因素。结果 (1) 3组患者在年龄、体质量指数(BMI)、窦卵泡数(AFC)、基础激素水平、用药情况、FSHR mRNA及获卵数等方面差异均有统计学意义(P<0.05)。(2) PCOS组促排卵后卵巢高反应患者FSHR mRNA表达量低于正常反应患者(P<0.05)。(3)对卵巢功能正常组患者FSHR mRNA主要与AMHmRNA(r=0.404,P<0.001)、LHR mRNA(r=0.388,P<0.001)呈正相关,预期低反应组患者FSHR mRNA主要与LHR(r=0.415,P<0.001)呈正相关,PCOS患者FSHR mRNA主要与AMHRⅡmRNA(r=0.311,P<0.001)呈正相关。结论不同卵巢储备患者促性腺激素(Gn)受体表达量存在差异,且Gn受体与AMHmRNA表达具有显著相关性,可能与卵巢储备异常发病机制相关,临床Gn用药可参考Gn受体表达情况进行选择。

益肾调肝Ⅱ号方对多囊卵巢综合征大鼠卵巢黄体生成素受体表达的影响

目的观察益肾调肝汤Ⅱ号方对多囊卵巢综合征(PCOS)模型大鼠卵泡发育、卵巢黄体生成素受体(LHR)表达的影响。方法 24日龄Wistar大鼠进行皮下埋植左炔诺孕酮结合皮下注射人绒毛膜促性腺激素造模,将造模成功60只大鼠随机分为6组,每组10只,未造模10只大鼠为正常组。分组灌服生理盐水、盐酸二甲双胍片、益肾调肝汤Ⅰ号方、益肾调肝汤Ⅱ号方低、中、高剂量15天后,观察动物卵巢重量,光镜观察卵巢卵泡的大小、黄体数;免疫组化分析LHR在卵巢中的表达情况。结果运用益肾调肝汤Ⅱ号方中、高剂量后,大鼠发育卵泡数增加,不成熟的早期发育卵泡减少,黄体数量增加,LHR表达增加。结论益肾调肝汤Ⅱ号方能明显增加大鼠卵巢重量、减少小卵泡数、增加黄体数,可明显增强LHR在卵巢中的表达,有利于卵泡的发育及排卵。

黄体生成素受体及类固醇激素合成急性调节蛋白在大鼠多囊卵巢综合征模型中的表达

目的:探讨黄体生成素受体(LHR)及类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)在大鼠多囊卵巢综合征(PCOS)模型中的表达及作用。方法:将50只21日龄SD大鼠随机分为模型组(PCOS组,n=35)和对照组(NC组,n=15)。通过注射脱氢表雄酮(DHEA)建立PCOS大鼠模型,放射免疫法和酶联免疫法分别检测血清孕酮(P)和雌二醇(E_2)水平及睾酮(T)水平;免疫组织化学法对LHR及StAR进行细胞定位分析,RT-PCR和Western blotting分别检测LHR及StAR mRNA和蛋白表达变化。结果:与NC组相比,血清E_2和T水平显著升高,P水平无显著变化;LHR和StAR mRNA和蛋白表达水平均显著升高。结论:PCOS高雄激素血症可能与LHR和StAR表达调控有关;两者与E_2水平升高之间的关系仍有待阐明。