高效定向驯化人工窖泥功能菌群及机制的研究

窖泥的质量和窖龄密切相关,且显著影响基酒的品质和产率。窖泥中功能菌群的形成是一个非常缓慢的过程,因此缩短优质人工窖泥(artificial pit mud,APM)的生产周期迫在眉睫。挖掘优良窖泥功能菌群资源,优化窖泥培养工艺是攻克发展障碍的关键。研究了太空(taikong,TK)大曲对窖泥群落结构的影响特点,确定了百年窖龄泥是人工窖泥功能菌群的强化源。TK大曲驯化生产APM及发酵后窖泥(pit mud,PM)显著改善了窖泥群落结构及挥发性代谢组分,提高了细菌群落的α-多样性。浓香型白酒酿造功能菌梭状芽孢杆菌(Clostridium_sensu_stricto_12)和古菌,尤其是甲烷八叠球菌(Methanosarcinales)的丰度显著增高了2~4倍,其中己酸和己酸乙酯是关键代谢物。研究结果可为基于优质窖泥和大曲的人工窖泥培养技术开发提供理论与技术支撑。

窖泥培养液配方优化及其在退化窖池养护中的应用

以浓香型白酒生产过程中的原材料、副产物为基础,研制窖泥培养液,对退化窖池进行养护。采用单因素试验对窖泥培养液基础配方进行优化,在单因素试验的基础上,采用Box-Behnken法,以老窖泥添加量、黄水添加量、培养温度和培养时间为因素对培养液进行优化。结果表明,当老窖泥添加量为11.80%、黄水添加量为10.80%、培养温度为37℃、培养时间为37 d时,窖泥培养液中的己酸产率达到最大值,为7.27 g/L。将培养液对退化窖池进行实践应用,原酒中己酸乙酯含量由1.74 g/L提升至3.47 g/L。

浓香型白酒窖泥中高产己酸兼性厌氧细菌的分离鉴定

筛选及鉴定白酒窖泥中高产己酸的细菌,以应用于窖池保养及人工窖泥培养。从东北地区某酒厂优质窖泥中采用兼性厌氧培养及微量成分分析的方法,分离筛选出3株(C78、a57、A17)高产己酸的兼性厌氧细菌,其产己酸量分别为:213.6914、170.465、103.5097mg/100mL,经形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定其分别为:巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、梭状芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),相应最适pH值分别为7、6.5、7,最适温度分别为34、34、37℃,最适接种量分别为5%、5%、3%。

浓香型白酒窖泥中兼性厌氧细菌的分离鉴定

为探讨浓香型白酒窖泥中微生物区系的构成,采用传统微生物分类鉴定法,对泸州老窖不同窖龄窖底和窖壁泥样的可培养兼性厌氧细菌进行了分类计数,并初步鉴定到属。平板涂布法计数得出,老窖底样的菌落总数最多,达3.98×103cfu/g泥,新窖壁样菌落数最少,只有0.24×103cfu/g泥;经生理生化鉴定,参照伯杰氏细菌鉴定手册等将划线单离后的菌株归为8个属,其大部分属于芽孢杆菌属(Bacillus)和芽孢乳杆菌属(Sporolac-tobacillus),也存在假单胞菌属(Pseudomonas)、梭菌属(Clostridium)等。

中国浓香型白酒窖池窖泥中原核微生物群落的空间异质性

利用16S rRNA基因克隆文库技术探索中国浓香型白酒窖池上、中、底三层窖泥中原核微生物群落构成的异质性和系统发育关系。结果表明:窖池不同层面的窖泥中细菌类群及数量的差异性较大。其中,优势菌群Clostridium diolis及Lactobacillus acetotolerans在上、中、底层窖泥中所占比例分别为34.9%和39.8%、25.2%和20.6%、23.8%和36.6%,Bacillus subtilissubsp.subtilis是中层窖泥优势菌群之一,占22.1%;古细菌群落主要分布在Methanoculleus属和Methanosarcina属。其中,Methanoculleus bourgensis在上层和底层窖泥中所占比例分别为89.9%和88.2%。Methanosarcina siciliae和Methanoculleus bourgensis在中层窖泥中所占比例分别为40.7%和49.1%。系统发育分析显示:窖泥细菌主要为杆菌目、梭菌目、肠杆菌目及以TM7 phylum sp.为代表的种属分类尚不明确的细菌,古细菌主要为甲烷微菌目与甲烷八叠球菌目。

浓香型白酒不同窖龄窖池窖泥中古菌群落结构分析

用高通量测序技术对浓香型白酒不同窖龄窖池窖泥中古菌群落结构进行研究,找出其差异性,并利用古菌群落结构信息对不同窖龄窖泥进行聚类分析,同时分析环境因子对各个窖龄段窖泥古菌的影响。结果表明,窖泥中的古菌群落主要分布于Euryarchaeota(占99%OTU数目),分布于7个属;窖泥中古菌的多样性与窖龄呈负相关,Methanobacterium和Methanocorpusculum的优势度与窖龄呈正相关,Thermoplasmatales的优势度与窖龄呈负相关;5 a窖龄的不同窖池窖泥和100 a窖龄不同窖池窖泥微生物群落相似性较高,30 a窖龄的不同窖池窖泥微生物群落差异性较大,对各窖龄段窖泥中古菌群落影响最大的环境因子各不相同。浓香型白酒不同窖龄窖池窖泥古菌群落结构差异性明显,这可能是不同窖龄窖池发酵产酒存在差异性的重要原因之一。

浓香型白酒窖泥中芽孢杆菌的分离鉴定及代谢产物分析

从浓香型白酒窖泥中筛选出3细菌,经磷脂脂肪酸(PLFA)鉴定,分别为球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaerieus)、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)、尘埃类芽孢杆菌(Paenibacillus larvae subsup.pulvifaciens)。采用固相微萃取结合气相色谱-质谱联用(SPME-GC-MS)技术分析3株菌发酵产物,结果表明,3株菌产风味物质能力较强且种类丰富,主要为高级醇、高级酮等芳香类化合物,它们作为白酒中的微量成分,对浓香型白酒风味的形成起着放香、助香及调香的作用。因此,这3株菌的代谢产物对浓香型白酒风味物质的形成有一定影响。

浓香型酒窖泥理化特性的研究

对浓香型酒窖泥理化特性进行了研究。结果显示,不同窖龄窖壁泥的pH值、锰、铁和镁含量均低于窖底泥,而锌、有机质及全氮含量均高于窖底泥;不同窖龄窖壁泥和窖底泥的pH值、全钾、镁以及锰含量差异均不显著(P>0.05)。新窖窖壁泥的锌、有机质、有效磷、有效氮含量均显著低于40年及以上窖龄窖壁泥(P<0.05),40年以后则随窖龄的增加而增加,但差异不显著(P>0.05)。窖泥中矿物元素含量高低为铁>镁>钙>铜>锰>锌。

浓香型白酒窖泥水分含量与水分活度的对比研究

为弥补水分含量指标在窖泥质量评价方面存在的缺陷,该研究引入水分活度指标用于浓香型窖泥质量评价。对比分析二者在不同地区、不同质量等级窖泥间的差异,研究其分布规律,以进一步完善浓香型窖泥质量评价体系。研究结果表明,水分含量与水分活度指标虽均未能完全区分开不同质量等级的窖泥,但与水分含量指标相比,水分活度指标在不同地区、不同酒厂窖泥间的分布趋势是一致的,受外界干扰因素影响更小,更适用于评价窖泥质量,值得进一步深入研究。

浓香型白酒窖泥、出窖糟醅细菌区系的相似性分析

分别建立多粮浓香型白酒窖池的窖泥和出窖糟醅的16S rRNA基因克隆文库,在利用DOTUR1.53软件对691条有效序列进行分析的基础上,对序列进行Blastn和EzTaxon相似性分析。发现窖泥和出窖糟醅中均存在丰富的细菌多样性;窖泥中180条序列分别与糟醅中264条序列100%相似,各占2个克隆文库序列总数的51.14%和77.88%,这些序列主要属于Lactobacillus、Staphylococcus、Serratia、Clostridium和一些潜在新类群。结果显示:多粮浓香型白酒发酵过程中,窖泥和糟醅具有较高相似度的细菌区系,其间存在较大规模的细菌相互扩散,发生相互扩散的细菌包括Lactobacillus、Serratia和Clostridium等属的菌株及大量潜在新分类单位菌株。

酱香型白酒窖内发酵过程中糟醅的微生物分析

以郎酒厂第4次酒入窖糟醅正常生产窖池为研究对象,研究发酵过程窖池糟醅中不同空间位置的微生物区系的动态分析。结果表明,酱香型白酒糟醅发酵过程糟醅上、中、下层不同层面的各类微生物区系在数量上存在一定差异,总的分布趋势为上层高于中、下层,兼性厌氧细菌及其芽孢杆菌的数量分布亦是上层略高于中、下层。(孙悟)

泸州老窖窖泥中重要功能菌群分布及代谢产物研究

通过对泸州老窖酒厂不同窖龄窖泥中五大功能菌群的数量分布、生态结构的研究,发现甲烷菌、己酸菌、丁酸菌的数量随窖龄而增加。同时,窖泥中酸类和酯类微量化学成分含量和种类随功能菌数量同步增加。在传统工艺的长期影响下,在窖泥发酵方面形成了一个相对稳定的化学生态环境和固有的微生物区系生态结构,它们是生产优质浓香型白酒的基础。本研究进一步揭示了窖泥功能菌的生理特征和特殊功能,为多菌种混合发酵培养人工窖泥母液提供技术指导,以此培养出优质窖泥,提高浓香型白酒的质量和产量。

不同质量窖泥细菌群落的研究

采用多聚酶链式反应结合变性梯度凝胶电泳指纹分析技术(PCR-DGGE),对不同质量窖泥中细菌群落结构进行分析,从微生物角度说明了不同质量窖泥细菌种群的复杂性,同时,鉴定出了常见的芽孢杆菌、醋酸杆菌等微生物,以及发现可能的新菌种和尚未在窖泥研究中报道的瘤胃球菌。以质量最好的窖泥为参照,其他窖泥的质量与其跟参照窖泥的细菌群落间相似性指数总体呈正相关。这一规律为今后研究窖泥培养、养护和应用提供了理论依据。

基于Miseq高通量测序技术的古襄阳酒窖泥细菌多样性评价

使用Miseq高通量测序技术对4份古襄阳酒业浓香型白酒窖泥样品的细菌多样性进行了评价,同时通过选择性培养分离出窖泥中的优势乳酸菌,再利用16S r DNA序列分析方法,对其进行初步鉴定。结果表明,乳酸杆菌是古襄阳酒窖池中的优势细菌,其相对含量高达92.02%。在分类操作单元(OTU)水平上,发现8个核心OTU相对含量>1.0%,其中7个隶属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)。4份古襄阳酒业浓香型白酒窖泥样品中共分离到12株菌株,初步鉴定其全部为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。

浓香型大曲酒窖泥中挥发性化合物的测定与分析

浓香型大曲酒窖泥中含有大量的挥发性风味成分。文章采用顶空固相微萃取/气相色谱-质谱法(HS-SPME/GC-MS)快速测定窖泥中的挥发性风味成分,首先通过单因素分析法对窖泥挥发性物质萃取过程中萃取头类型、萃取温度、萃取时间以及解吸时间重要萃取条件进行优化。优化结果表明在55℃水浴中,采用50/30μm碳分子筛/聚二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)萃取头在样品上方顶空吸附40min并解吸5min效果最佳。GC-MS鉴定结果表明,检测出50种挥发性风味物质,主要为25种酯类、8种醇类、6种酸类、3种醛类和3种酚类,发现与浓香型白酒中的风味成分保持一致。相对于传统的萃取方法,该方法检测出了更多种类的挥发性物质,同时操作简单、迅速且灵敏度高、重复性良好,可广泛应用于窖泥的挥发性风味成分测定,为探讨窖泥与白酒品质的关系提供了数据参考。

不同窖龄窖泥微量挥发性成份研究

应用气相色谱检测技术,对浓香型白酒不同窖龄窖泥微量挥发性成份进行了分析。结果表明:不同窖龄窖泥中微量挥发性成份种类和含量不同;任何窖龄的窖池均是窖壁泥微量挥发性成份种类和含量比窖底泥多;酸类和酯类化合物含量随着窖龄增长而增加,主要增加于窖壁泥。

不同窖龄窖泥微生态变化研究

对泸州老窖不同窖龄的窖底泥与窖壁泥中的微生物变化进行了研究。结果表明:窖壁泥的好氧细菌数量和窖底泥的好氧芽孢细菌数量均随着窖龄的增加呈逐渐降低趋势,而窖壁泥的好氧芽孢细菌数量和窖底泥的好氧细菌数量均随着窖龄的增加呈先降后升的趋势;窖底泥的厌氧细菌和厌氧芽孢细菌以及窖壁泥的厌氧芽孢细菌数量随着窖龄的增加呈逐渐增加的趋势,不同窖龄的窖壁泥的厌氧细菌数量没有明显差异;不同窖龄的窖泥的好氧细菌、好氧芽孢细菌、厌氧细菌以及厌氧芽孢细菌数量总趋势为窖底泥显著高于窖壁泥;不同窖龄的窖泥中的霉菌和酵母菌数量均较少。

剑南春窖泥理化特性及矿质元素变化趋势研究

系统研究了剑南春2年、5年、10年、20年和50年窖龄窖泥的理化特性及矿质元素差异与规律。结果表明,不同窖龄窖泥的水分含量差异不明显,腐殖质含量随着窖龄的延长呈缓慢下降趋势,而pH、氨氮和有效磷等指标,均以10年窖龄为分界线出现较大差异;矿质元素中,除了Cu元素含量随窖龄延长呈缓慢下降趋势外,Ca、Fe、Mg、Mn和Zn等元素含量均在10年窖龄时出现显著的提高,并在之后的10年中保持相对稳定,表明10年窖龄可能是剑南春窖泥成熟的一个重要时间节点。

窖泥功能菌液在窖泥养护中的应用

通过不同比例的己酸菌、液体窖泥菌液和窖泥复合功能菌液混合液在窖泥养护中的对比研究表明,对于新窖泥的养护,采用己酸菌、液体窖泥菌液:窖泥复合功能菌液为1∶1的混合菌液效果最佳;对于退化窖泥的养护,采用己酸菌、液体窖泥菌液:窖泥复合功能菌液为1∶2的混合菌液效果最佳。

优质人工窖泥的研制与应用

从优质老窖泥中分离选育出优良窖泥功能菌株,与优质窖泥一起进行多菌复合培养,生产功能性人工窖泥,将功能性人工窖泥用于新建或改建窖池,效果十分显著。结果表明,功能性窖泥能改善窖泥风味,增强窖泥的酯香味,减少新窖产酒的邪杂味和泥臭味,增加新酒中的主体香及其复杂香味成分,改善了酒体风格,增强新产酒的绵柔度和纯净感。