脂多糖刺激下骨髓间充质干细胞分泌的外泌体对Ly6C单核巨噬细胞亚群的影响

目的探索炎症刺激下,骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)产生的外泌体对小鼠淋巴抗原6C高表达(Ly6C^(high))单核巨噬细胞和Ly6C^(low)两个亚群比例的影响。方法梯度离心法分离BMSCs,鉴定其形态、表面标记及成脂诱导分化能力。脂多糖处理BMSCs 48h,收集上清并提取外泌体,采用Western blot法、透射电镜以及粒径分析鉴定外泌体。磁珠分选小鼠腿骨中的单核巨噬细胞,与外泌体共培养24 h后,LPS刺激48 h,流式细胞术检测Ly6C亚群变化。ELISA检测细胞上清炎症因子的变化。结果 BMSCs表达CD44、CD90等,不表达CD34、CD45,并有成脂分化能力。外泌体表达CD63,粒径大小为(82.4±3.70)nm,LPS刺激下BMSCs产生较多的外泌体(P<0.01)。与LPS组相比,外泌体可以使Ly6C^(high)单核细胞比例上升(P<0.01),Ly6C^(high)巨噬细胞比例下降(P<0.05),且LPS刺激BMSCs产生的外泌体比正常BMSCs产生的外泌体的作用更加明显(P<0.05)。促炎因子IL-6水平也明显上调(P<0.05)。结论 BMSCs产生的外泌体可以改变Ly6C^(high)单核巨噬细胞亚群比例,为BMSCs的临床治疗提供了新的靶点。

熊胆粉及熊去氧胆酸对原发免疫性血小板减少症小鼠骨髓和循环血Ly6C^(hi)单核细胞及其细胞因子的影响

目的:观察熊胆粉及熊去氧胆酸对原发免疫性血小板减少症(ITP)模型小鼠骨髓和循环血Ly6C^(hi)单核细胞分布及相关细胞因子含量的影响,探讨其对ITP的作用机制,为蒙药熊胆替代品研究提供依据。方法:利用豚鼠抗小鼠血小板血清(APS)复制/建立ITP模型,将小鼠随机分为正常组、模型组、泼尼松组、熊胆组和熊去氧胆酸组,治疗10 d。流式细胞仪检测骨髓和循环血Ly6C;单核细胞分布,酶联免疫吸附(ELISA)测定血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)含量。结果:与模型组比较,熊胆组和熊去氧胆酸组骨髓Ly6C^(hi)单核细胞表达率显著升高(P<0.05),而循环血Ly6C;单核细胞表达率显著减少(P<0.05),外周血TNF-α和IL-1β含量显著减少(P<0.05)。结论:熊胆粉及熊去氧胆酸可通过抑制Ly6C^(hi)单核细胞从骨髓进入循环血,改善炎症因子的分泌,从而发挥治疗ITP作用。

CD24调节Ly6C^hi巨噬细胞和胆管结扎所致肝纤维化的实验研究

目的探讨CD24分子对肝内Ly6C^hi巨噬细胞的调节作用及其对胆管结扎(BDL)诱导的小鼠胆汁淤积型肝纤维化的影响。方法建立小鼠胆管结扎诱导肝纤维化模型,H&E染色观察肝组织形态学变化,天狼星红(Sirius Red)染色观察肝纤维化程度,血清学方法检测转氨酶改变,real-time PCR检测肝纤维化相关指标以及TGF-β1的mRNA表达,免疫荧光观察肝组织中α-SMA表达,流式细胞术检测肝内巨噬细胞比例和数量变化以及TGF-β1的分泌。结果在BDL诱导的小鼠肝纤维化模型中,CD24敲除(CD24^-/-)小鼠与野生型小鼠(WT)相比,H&E结果显示肝脏炎性浸润增多,汇管区胆管增生更为严重。同时,血清学结果显示谷丙转氨酶(ALT)表达水平明显升高。Sirius Red染色结果表明CD24^-/-小鼠肝纤维化程度明显大于WT小鼠,肝纤维化相关指标的mRNA表达也显著升高。流式细胞术分析发现,肝内巨噬细胞高表达CD24分子,WT小鼠造模后肝内的巨噬细胞比例和数量明显少于CD24^-/-小鼠,进一步分析发现CD24^-/-小鼠的肝内Ly6C^hi巨噬细胞比例明显高于WT小鼠,其Ly6Clo巨噬细胞比例无明显差异。Real-time PCR结果显示,CD24^-/-小鼠肝组织中TGF-β1的表达高于WT小鼠。细胞内染色后进行流式分析发现,造模后CD24^-/-小鼠肝脏中的Ly6C^hi巨噬细胞比WT小鼠分泌更多的TGF-β1。结论CD24分子可能通过调节Ly6C^hi巨噬细胞在肝中的比例和其TGF-β1的分泌,从而减轻了BDL诱导的肝纤维化。

实验性肺纤维化小鼠循环单核细胞亚群的动态变化及意义

目的：外周血单核细胞表型偏移失衡与肺纤维化病理进展关系密切。文中通过阐述循环单核细胞亚群在实验性肺纤维化小鼠不同病理时期的动态变化，探讨其表型偏移与肺组织炎症和纤维化的关系。方法100只雄性C57 BL/6 J小鼠随机数字表法分为等渗盐水组和博莱霉素组，经口咽吸入法分别给予等渗盐水及博莱霉素A5，术后第1、3、7、14及21天处死小鼠，病理学方法计算各组小鼠肺组织炎症评分（inflammation score， IS）及胶原容积分数（collagen volume fraction， CVF），常规方法进行支气管肺泡灌洗液（ bronchoalveolar lavage fluid ， BALF）细胞计数及分类计数，荧光定量PCR法检测各组小鼠肺组织胶原Ⅰ、胶原Ⅲ的mRNA表达量，氯胺T法检测肺组织羟脯氨酸（ hydroxyproline ， HYP）含量，流式细胞术检测循环单核细胞亚群的变化。结果博莱霉素组小鼠第3天炎性细胞浸润、肺泡壁水肿等炎症程度（ IS评价）较等渗盐水组显著增加（P＜0．01），第7天达到峰值后呈下降趋势。博莱霉素组小鼠第14、21天肺组织CVF较等渗盐水组明显增高（P＜0．01）；与等渗盐水组相应时间点比较，博莱霉素组第1天细胞总数无明显变化，第3天明显增多（25．18±2．06 vs 8．82±1．59， P＜0．01），第7天升至高峰（56．56±5．03 vs 3．68±0．79， P＜0．01），后呈下降趋势，但第14～21天细胞总数仍高于等渗盐水组（P＜0．01），肺泡巨噬细胞比例的变化趋势与细胞总数相一致；而中性粒细胞数量第1、3、7天显著高于等渗盐水组（9．086±1．268 vs 1．108±0．229、5．551±0．511 vs 0．315±0．100、8．093±0．922 vs 0．249±0．074），差异均有统计学意义（P＜0．01）；博莱霉素组胶原Ⅰ、ⅢmRNA表达水平在第14、21天显著高于等渗盐水组（ P＜0．05）；HYP检测结果显示博莱霉素组第7、14、21天高于等渗盐水组（P＜0．01），其中第21天达最高值；与等渗盐水组相比，博莱霉素组第1天Ly6Chi单核细胞亚群比例显著升高，第3天达到高峰（P＜0．01），此后呈降低趋势，Ly6Clo亚群比例变化与之相反。各组小鼠Ly6Chi单核细胞比例与IS及CVF值均呈正相关（P＜0．01，P＝0．0013）。结论在博莱霉素A5诱导的小鼠肺纤维化模型中，不同病理生理阶段外周血中Ly6Chi、Ly6Clo单核细胞亚群比例处于动态变化，与肺组织炎性细胞渗出、浸润等病理进程相比，Ly6Chi单核细胞亚群应对肺组织损伤、炎症反应迅速，早期Ly6Chi单核细胞亚群比例的升高可能与肺组织炎症反应及后期纤维化程度存在密切的联系。

石英诱导小鼠矽肺模型中循环单核细胞亚群的动态变化及意义

目的矽肺是一种以肺纤维化为病理特征的疾病,其发病机制仍不完全清楚,外周血单核细胞表型偏移失衡在肺纤维化病理进展中发挥着重要作用。文中旨在研究石英诱导小鼠矽肺（pneumosilicosis）模型中循环单核细胞亚群在不同病理阶段的变化特点,探讨其动态变化与肺炎症损伤和纤维化的关系。方法 100只雄性C57BL/6小鼠（18～22 g）随机数字表法分为等渗盐水组和石英组,石英组滴注吸入40 m L石英混悬液（100 mg/kg）,等渗盐水组滴注吸入相同体积无菌等渗盐水。经术后第1、3、7、14和28天应用流式细胞术检测循环单核细胞亚群变化;常规支气管肺泡灌洗术后进行炎症细胞分类计数;HE染色和苦味酸天狼星红染色检测小鼠肺组织炎症评分及胶原容积分数。结果病理染色显示,造模后第7天,小鼠肺组织可见明显的矽结节;与等渗盐水组相比,石英组小鼠肺组织炎症评分、胶原容积分数显著升高[（1.400±0.089）vs（0.920±0.049）、（1.950±0.065）vs（0.525±0.048）,P〈0.01],并持续到第28天[（1.520±0.136）vs（0.800±0.089）,（5.300±0.776）vs（0.850±0.050）,P〈0.01];与相应时间点等渗盐水组比较,石英组BAFL细胞总数于第1天开始升高[（7.693±2.495）vs（2.008±0.901）,P〈0.01],在第3天达到高峰[（13.346±3.563）vs（1.044±0.695）],随后第7、14、28天呈现递减趋势,但仍都高于等渗盐水组（P〈0.01）;石英组BALF巨噬细胞绝对值在第3天时显著高于等渗盐水组（6.821±2.627 vs 0.980±0.663,P〈0.01）,并在第7天维持于高水平状态[（6.697±1.864）vs（1.225±0.601）,P〈0.01],后呈下降趋势,但第14及28天巨噬细胞绝对值仍高于等渗盐水组（P〈0.01）;石英组BALF中性粒细胞绝对值在第1、3、7及14天都显著高于等渗盐水组（P〈0.01）,且呈现出逐渐下降的趋势,在第28天与等渗盐水组差异无统计学意义（P〉0.05）。石英组小鼠Ly6Chi单核细胞亚群占比在所有检测时间点均显著高于等渗盐水组（P〈0.01）,其中第7天达到高峰[（78.300±2.517）vs（58.750±2.386）,P〈0.01];Ly6Clo亚群比例变化与之相反。第7天和第28天的小鼠Ly6Chi单核细胞亚群占比与相应时间点的IS及CVF值呈正相关（P〈0.01）。结论循环Ly6Chi和Ly6Clo单核细胞亚群占比在石英诱导的小鼠矽肺的不同病理时期呈现动态变化,持续性的Ly6Chi单核细胞亚群占比升高可能与矽肺的急慢性炎症及后期的纤维化程度存在密切的联系。

内皮素-1 B型受体拮抗剂通过抑制NLRP3/IL-1β炎症小体通路缓解ApoE^(-/-)小鼠的动脉粥样硬化

目的探讨内皮素-1(ET-1)B型受体拮抗剂BQ-788治疗动脉粥样硬化的效果及其分子机制。方法使用24只8周龄ApoE^(-/-)小鼠(遗传背景为C57BL/6小鼠)构建晚期动脉粥样硬化模型,并分为饲喂常规啮齿类动物基础饲料的正常饮食(CHOW)组、饲喂高脂饮食(HFD)饲料的HFD组和饲喂HFD饲料并给予BQ-788治疗的HFD+BQ-788组。ELISA测定各组小鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。Western blot测定小鼠胸主动脉血管NLRP3炎症小体相关因子Caspase-1 p20、Caspase-1 p45、NLRP3和IL-1β的表达水平。流式细胞术测定小鼠全血单核细胞及单核细胞Ly6C^(high)、Ly6C^(low)亚型细胞数量。油红O染色测定小鼠胸主动脉血管动脉粥样硬化斑块面积;HE染色测定斑块“帽”的厚度;Masson染色观察斑块胶原沉积情况。结果与CHOW组相比,HFD组小鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平显著升高(P<0.01);炎症小体相关因子Caspase-1 p20、NLRP3和IL-1β的表达水平显著上调(P<0.01);单核细胞及全血中促炎单核细胞Ly6C^(high)数量显著增加(P<0.01),全血中抗炎单核细胞Ly6C^(low)数量显著减少(P<0.01)。与HFD组相比,HFD+BQ-788组小鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平明显回落(P<0.05);炎症小体相关因子Caspase-1 p20、NLRP3和IL-1β的表达水平显著下调(P<0.01);单核细胞及全血中促炎单核细胞Ly6C^(high)数量显著回落(P<0.01),全血中抗炎单核细胞Ly6C^(low)数量显著增加(P<0.01);小鼠胸主动脉血管的油红O阳性着色面积占比显著较低(P<0.01);动脉粥样硬化斑块“帽”的平均厚度显著较小(P<0.01);斑块的胶原沉积范围明显较小。结论ET-1B型受体拮抗剂BQ-788可通过抑制NLRP3/IL-1β炎症小体通路缓解ApoE^(-/-)小鼠的动脉粥样硬化。

CCR2抑制剂延缓输尿管结扎小鼠肾纤维化

目的探究趋化因子受体2(CCR2)抑制剂(RS504393)在小鼠肾纤维化中的作用及其机制。方法将小鼠随机分为假手术组(sham组,单侧输尿管分离术)、UUO模型组(单侧输尿管结扎术)和给药组(UUO+RS504393,术前3天开始灌胃给予RS504393 25 mg/kg,早晚各1次,连续17 d);用Masson染色和HE染色观察肾脏纤维化程度和炎性细胞变化;流式细胞计量术分析各组小鼠肾脏CCR2及CD11b^+Ly6C^+单核细胞的比例。结果 UUO模型组肾间质炎性细胞数量较假手术组明显增多(P<0.05),给药组炎性细胞数量较模型组显著减少(P<0.05);UUO模型组肾脏胶原蛋白沉积面积较假手术组显著增加(P<0.05),给药组胶原沉积面积较模型组明显减少(P<0.05);UUO模型组肾脏CCR2比例较假手术组显著增多(P<0.05),给药组CCR2比例较模型组减少(P<0.05);UUO模型组肾间质CD11b^+Ly6C^+单核细胞群比例较假手术组明显增加(P<0.05),给药组CD11b^+Ly6C^+单核细胞群比例较模型组明显减少(P<0.05)。结论 CCR2抑制剂RS504393可减少CD11b^+Ly6C^+单核细胞浸润延缓肾脏纤维化。

血吸虫感染肝脏纤维化进程中巨噬细胞型别的动态变化

目的研究日本血吸虫感染诱发虫卵肉芽肿和肝纤维化进程中,巨噬细胞型别的动态变化及其功能特点。方法通过腹部敷贴尾蚴法建立日本血吸虫感染小鼠模型,每只小鼠感染(17±2)条尾蚴;将15只小鼠随机分为第8、9、10周观察组小鼠,每组5只,于感染6周后给予吡喹酮(PZQ)连续灌胃治疗5 d,在去除肝损伤刺激因素后,于第8、9、10周处死小鼠,取材进行肝纤维化相关分析,观察肝脏纤维化的进程转归。采用Masson染色观察小鼠病理变化和肝纤维化程度,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测小鼠肝纤维化相关基因平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Col I)、Ⅲ型胶原(ColⅢ),细胞外基质(ECM)降解相关基因基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP),肝内损伤因子相关基因如白细胞介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)的表达,流式细胞术分析Ly6C^(hi)和Ly6C^(lo)2个肝内巨噬细胞亚群在肝内的表达。结果尾蚴感染第8周后,小鼠肝脏出现明显的肝纤维化,说明造模成功;Masson染色示第10周小鼠相对于第8周肝纤维化程度明显减轻,差异有统计学意义(t=5.515,P=0.005)。qPCR结果表明,与第8周相比,第10周肝纤维化标志基因α-SMA与Col I、ColⅢ基因水平表达量显著下调,差异均有统计学意义(t=2.731、3.492、5.434,P=0.041、0.025、0.006),细胞外基质降解相关基因TIMP显著下降,差异有统计学意义(t=4.323,P=0.008),肝内损伤因子如IL-1、TNF-α、TGF-β基因表达水平无显著变化。流式分析结果显示,第10周小鼠肝内Ly6C^(lo)巨噬细胞亚群比例高于第8周,差异有统计学意义(t=4.987,P=0.008)。结论在血吸虫感染及PZQ杀虫治疗后的不同阶段,肝脏巨噬细胞Ly6C^(lo)CCR2^(+)CX3CR1^(+)呈现动态变化,同时伴随基质重塑作用的增强。