淋巴毒素α多态性位点与中国汉族非心源性缺血性卒中的关联研究

目的在中国汉族人群中研究淋巴毒素α(lymphotoxinα,LTA)基因多态性位点是否为非心源性缺血性卒中的危险因素。方法采用Taqman-MGB探针法在558名非心源性缺血性卒中患者和557名健康成人中对LTA的rs1800683、rs909253、rs1041981三个多态性位点进行基因分型。在单核苷酸多态性水平和单体型水平进行关联分析,并使用Bonferroni法进行多重检验校正。结果 LTA的三个单核甘酸多态性的不同等位基因和基因型在非心源性缺血性卒中组和对照组分布未见统计学差异。以最常见的单体型AGA作为参照,在校正传统危险因素后,GGC携带者有0.381倍卒中发病风险(95%CI:0.198～0.733,P=0.003)。结论 GGC单体型可能是非心源性缺血性卒中发病的保护性因素,有待于在前瞻性研究中进一步证实。

国人肿瘤坏死因子的基因多态性与H pylori感染无相关性

目的:探讨肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)和淋巴毒素-α(lymphotoxin-α, LT-α,即TNF-β)基因多态性与国人幽门螺杆菌(H pylori)感染的相关性,探讨宿主遗传因素对H pylori感染易感性的相关性．方法:采用序列特异性聚合酶链式反应方法分析264例武汉健康正常人外周血白细胞基因组DNA、TNF-α 308、LT-α Nco Ⅰ、LT-α AspH Ⅰ基因多态性．结果:健康正常人H pylori阳性率62．1％ (164/264),TNF-α 308、LT-α AspH Ⅰ、 LT-α Nco Ⅰ基因多态性在H pylori感染组(即 H pylori+组)和无H pylori感染组(即H pylori 组)间分布无显著性差异．中国人TNF-α 308 的基因型和等位基因频率分布与西班牙高加索人接近,但LT-α AspH Ⅰ GG型明显低于高加索人(P<0．000 1,OR=0．207,95％CI: 0．104 6-0．409 6),而CC型却显著高于对方(P =0．005 7,OR=2．043．95％CI:1．241-3．366); LT-α Nco Ⅰ GG型比高加索人明显增高(P= 0．000 4,OR=3．644．95％CI:1．677-7．915),AA 却低于高加索人(P=0．000 1,OR=0．396 3, 95％CI:0．247 1-0．635 7)．结论:中国人TNF-α 308、LT-α Nco Ⅰ、LT-α AspH Ⅰ基因多态性与H pylori的感染无相关性．

靶向肿瘤坏死因子β小分子抑制剂的筛选及其功能鉴定

目的 通过计算机虚拟筛选和细胞活性筛选,获得能靶向抑制肿瘤坏死因子β（TNFβ）的细胞毒活性的小分子抑制剂。方法 根据TNFβ与肿瘤坏死因子Ⅰ型受体（TNFR1）结合的复合晶体结构,采用计算机虚拟筛选方法初步选择对接结果较好的105个小分子化合物（C1~C105）,并对其进行细胞活性筛选;MTT法检测小分子化合物抑制TNFβ对L929细胞的细胞毒性;流式细胞术测定小分子化合物对TNFβ引起的细胞凋亡的抑制作用;采用碘化丙啶（PI）单染和流式分析技术检测小分子化合物对L929细胞周期的影响;采用Western blot和双转盘激光共聚焦显微镜分析小分子化合物对TNFβ引起的下游Caspase 3活化的抑制作用。结果 C35能有效抑制TNFβ引起的细胞毒作用,且这种抑制作用呈现剂量依赖性（半数抑制浓度=8.19μmol/L）;C35具有较低的细胞毒性,且对L929细胞周期无影响;C35能阻断TNFβ与其受体结合后引起的细胞凋亡通路,显著抑制TNFβ引起的L929细胞凋亡。结论 成功筛选到一个TNFβ小分子抑制剂C35,其能阻断TNFβ引起的细胞凋亡通路,高效抑制TNFβ的细胞毒活性。

LTA单核苷酸多态性与胃癌易感性关系的研究进展

尽管世界范围内胃癌的发病率和死亡率有下降趋势,但是近年来我国胃癌发病率和死亡率仍在逐渐上升,已经成为影响人们生存质量的主要因素之一。胃癌的发病机制与多种因素有关,涉及基因多态性、炎性细胞因子及生化机制等,其中淋巴毒素-α(LTA)基因单核苷酸多态性成为近年来研究胃癌致病机理的热点之一。目前发现LTA rs909253(A/G)、rs1041981(C/A)、rs2229094(T/C)、rs746868(G/C)等与胃癌患病风险有一定关联,但尚未得出一致性的结论。本文就目前LTA基因多态性与胃癌易感性的研究进展进行综述。

尼罗罗非鱼淋巴毒素α基因克隆与表达分析

【目的】克隆尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)淋巴毒素α基因(lymphotoxin alpha, LTα),分析该基因的组织分布,探讨该基因在抗菌抗病毒免疫过程中的重要作用。【方法】通过RACE技术获得尼罗罗非鱼淋巴毒素α基因(On-LTα)的cDNA全长,通过生物信息学分析其序列结构特征;利用实时荧光定量PCR检测基因的组织分布特征,以及健康尼罗罗非鱼感染无乳链球菌后该基因的表达变化,并进一步分离出尼罗罗非鱼非特异性毒性细胞(NCC),检测脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激后,On-LTα在NCC中的表达变化。【结果】On-LTα基因序列全长为2769 bp,包含705 bp开放阅读框(ORF),编码234个氨基酸(GenBank登录号:MK770358)。该蛋白属于跨膜蛋白,具有肿瘤坏死因子(TNF)家族保守结构域。实时荧光定量结果表明,On-LTα在健康尼罗罗非鱼11种组织中均有表达,在脾脏中的表达量最高;无乳链球菌刺激后,该基因在脾脏中的表达量显著升高;LPS与PolyI:C刺激后,On-LTα在NCC中表达量也显著上调。【结论】On-LTα参与了尼罗罗非鱼抗菌抗病毒的免疫应答过程。

重组人淋巴毒素α的高密度发酵、复性和纯化

目的建立和优化重组人淋巴毒素α(rhLT-α)工程菌高密度发酵方法以及目的蛋白的复性和纯化方法,得到高纯度的重组人淋巴毒素α。方法高密度发酵rhLT-α工程菌,超声破碎细胞提取包涵体,经过复性后,用DEAE Sepharose FF,Phenyl Sepharose FF(LS)进行分离纯化。结果重组人淋巴毒素α以包涵体形式表达,经过破碎离心收集包涵体,洗涤后包涵体纯度达到85%以上。复性后,经两步纯化,最终目的蛋白纯度达98%以上。活性达6×108U/mg以上。结论建立了高效简便的淋巴毒素生产工艺,为淋巴毒素的规模生产打下了基础。

白细胞介素-10和肿瘤坏死因子基因多态性与湖北汉族人群胃十二指肠疾病及幽门螺杆菌感染的相关性

目的研究我国湖北汉族人群IL-10及TNF的基因多态性与胃十二指肠疾病及幽门螺杆菌（Hp）感染的关系。方法采用病例对照研究和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法检测605例胃十二指肠疾病患者（包括196例慢性胃炎、189例胃十二指肠溃疡及220例胃癌患者）和624例健康对照者中IL-10基因启动子区3个位点（IL-10—1082／-819／-592）的等位基因型和TNFα-308、LTα（淋巴毒素α，亦称TNFβ）NcoI、AspHI双等位基因型分布；用ELISA法检测血清中Hp．IgG及CagA．IgG抗体水平。结果（1）IL-10—1082AG＋GG基因型在胃癌组、慢性胃炎组及胃十二指肠溃疡组（非胃癌组）、健康对照组分布频率分别为20．O％、7．5％、6．0％和5．0％，IL-10—1082AG＋GG基因型分布在非胃癌组及健康对照组之间差异无统计学意义（P〉0．05），而胃癌组高于非胃癌组（P〈0．05）及健康对照组（P〈0．05），其差异均有统计学意义。胃癌组中IL-10-592及-819两个位点与非胃癌组及健康对照组比较，基因型分布差异无统计学意义（P〉0．05）。IL-10—819位点与IL-10-592位点基因型分布频率-致。（2）胃癌组与其余3组比较，IL-10—1082AG＋GG基因型且Hp阳性的分布频率的差异有统计学意义（P〈0．05）。（3）LTαNcoIAG基因型在Hp阳性胃癌患者中（66．7％）高于Hp阳性的健康对照组（47．8％），差异有统计学意义（P〈0．05），该基因型与其他胃十二指肠疾病无相关性。TNFα-308、LTdAspHI与Hp感染及胃十二指肠疾病亦无相关性。结论（1）IL．10—1082AG＋GG基因型与湖北地区汉族人群胃癌发生有相关性。（2）IL-10—1082AG＋GG基因型和LTαNcoIAG基因型与湖北汉族人群Hp阳性胃癌有相关性。

肾上腺髓质素对大鼠肾脏损伤早期肿瘤坏死因子及其受体表达的影响

目的探讨外源性肾上腺髓质素（ADM）对肾脏机械性损伤早期肿瘤坏死因子（TNF-α、TNF—β）及TNF受体（TNFR）表达的影响。方法健康成年普通级Wistar大鼠104只，随机分为4组：正常对照组（8只）、单纯创伤组（32只）、伤前给药组（32只）和伤后给药组（32只）；后3组采用自由落体打击仪直接打击大鼠脊肋区制作肾机械性损伤模型。两给药组分别于创伤前、后10min腹腔注射ADM（0．1 nmol／kg）。3组肾损伤大鼠平均分为4批分别于创伤后1、6、12和24h，采用快速心脏采血法处死。迅速解剖动物提取肾脏标本，10％甲醛固定。免疫组织化学染色，观察肿瘤坏死因子TNF-α、TNF-β、TNFR在组织中的表达，并进行统计学分析。结果TNF—α表达：单纯创伤组在创伤早期（1、6h）高于正常对照组；伤前给药组创伤后6h，伤后给药组创伤后1h均低于同时相点单纯创伤组，差异均具有统计学意义（P〈0．05，P〈0．01）。TNF—β表达：单纯创伤组于伤后1、6h均低于正常对照组，差异均具有统计学意义（P〈0．05）；伤后给药组伤后1、6h均高于单纯创伤组同时相点，差异均具有统计学意义（P〈0．01）。TNFR表达：单纯创伤组于创伤后6h低于正常对照组（P〈0．01）；伤前给药组伤后1、6h高于同时相点单纯创伤组，差异均具有统计学意义（P〈0．01）。结论TNFR对TNF-α与TNF-β具有动态调节作用且以TNF-α为主。TNF-β在肾脏损伤中主要参与的是抗损伤过程。ADM能降低TNF—α的分泌，在肾损伤早期可以上调TNF—β和TNFR。

TNFα rs1800629和LTA rs909253突变位点可能不是我国散发性帕金森病发生的易感因素

目的探讨TNFα基因-308G>A和LTA基因252A>G多态性对PD发病潜在影响。方法利用Pyrosequencing技术对114例我国汉族散发性帕金森病(Parkinson's disease,PD)患者和133例正常对照进行TNFα-308G>A和LTA252A>G突变位点分析。结果病例组TNFα-308突变型(G/A+A/A)和野生型(G/G)阳性率与对照组相等,差异无统计学意义(χ2=3.46,P=0.0627)。病例组LTA252突变型(A/G+G/G)阳性率稍高于对照组,差异无统计学意义(χ2=0.28,P=0.5999)。单倍体型分析表明,TNFα-308杂合突变型(G/A)患者LTA252位点均为突变型(A/G或G/G)。结论TNFα-308和LTA252位点可能不是我国散发性PD发病易感因素。

淋巴毒素α基因rs2239704 A>C位点多态性与川崎病的关联性研究

目的探讨淋巴毒素α（LTA）基因rs2239704 A〉C位点多态性与儿童川崎病（KD）及其并发冠状动脉损伤（CAL）的关联性。方法收集2000至2015年间100例川崎病病例与92例健康儿童血样本,提取外周血基因组DNA,应用基因测序方法检测LTA基因rs2239704 A〉C位点多态性;采用χ^2检验比较各组间的差异。结果 KD组LTA基因rs2239704 A〉C位点的AC、AA、CC基因型分布和A、C等位基因频率与健康对照组比较差异无统计学意义（χ^2=3.3、0.81,均P〉0.05）,川崎病组合并CAL组与无CAL组LTA基因rs2239704 A〉C位点的基因型和等位基因频率比较差异亦无统计学意义（χ^2=0.71、0.04,均P〉0.05）。结论未发现LTA基因rs2239704 A〉C位点多态性与川崎病的发病及其CAL存在明显关联性。