流产布鲁菌LysR家族转录调控子LTTR8缺失株的构建及其生物学特性分析

布鲁菌是一种重要的人畜共患病病原,兼性胞内寄生,无典型毒力因子,毒力相关基因的研究对阐明布鲁菌持续感染的机制具有重要意义。本研究以流产布鲁菌S2308为亲本株,通过同源重组的方法,构建流产布鲁菌LysR家族转录调控子基因bab_RS24670缺失株ΔlttR8,基于广宿主质粒pBBR1MCS构建成互补株ΔlttR8-Com。免疫印迹试验表明:ΔlttR8为光滑型菌株;体外培养分析发现lttR8缺失不影响布鲁菌的生长;细胞感染试验发现lttR8缺失不影响布鲁菌黏附、入侵细胞和胞内存活的能力。耐受性试验分析发现:lttR8缺失不影响布鲁菌对过氧化氢(H2O2)和多粘菌素B(polymyxin B)的敏感性。小鼠感染试验分析发现lttR8缺失显著减弱流产布鲁菌的毒力。综上所述,本研究发现一个新的与流产布鲁菌致病性相关的转录调控子,为布鲁菌致病机制研究提供参考。

TetR家族转录调控子基因敲除对鲍曼不动杆菌生物被膜生成能力的影响

目的:研究TetR家族转录调控子(TFR)基因敲除对鲍曼不动杆菌生物被膜(BF)生成能力的影响。方法:通过构建自杀质粒的方法敲除鲍曼不动杆菌SZ042株TFR基因,并设计内部引物和外部引物的方法进行敲除株的验证,采用结晶紫染色法对比观察和定量分析基因敲除前后BF生成的情况。结果:成功敲除鲍曼不动杆菌中TFR基因,获得TFR基因敲除株SZ042/ΔtetRt株;与野生株相比,敲除株菌膜形成量明显下降,培养4、8、12、16、24 h BF的生成量差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:TFR基因对鲍曼不动杆菌被膜生成和形态维持有促进作用,可以作为开发针对鲍曼不动杆菌BF生成机制的新型抗菌药物的潜在靶点。

TetR家族转录调控基因tfpA对链霉菌合成A21978C的影响

目的研究A21978C产生菌中一个Tet R家族转录调控基因tfp A对A21978C产量的影响。方法利用同源重组方法敲除该tfp A基因,HPLC检测突变株A21978C产量的变化,通过过表达与回补实验验证其调控特性。结果敲除tfp A基因的突变株A21978C产量与亲株相比增加了50%;基因回补后A21978C产量恢复到亲株的水平。过表达突变株则几乎不产A21978C。结论Tet R家族转录调控基因tfp A对A21978C的合成至关重要,是一个负调控基因。

MsiR高可溶性蛋白突变株的筛选

外源蛋白在表达宿主中的可溶性是影响其应用的关键因素。采用m Cherry报告基因,构建Msi R-m Cherry融合蛋白,通过测定荧光值定性定量的测定Msi R蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。随后,利用易错聚合酶链反应(Errorprone-PCR)和致突变菌株(XL1-Red)两种方式构建了msi R-m Cherry基因突变文库,经筛选得到了4株在大肠杆菌中以37℃作为诱导温度下可溶性明显提高的蛋白突变体。

中慢生型天山根瘤菌MsiR组成型蛋白突变株的筛选

MsiR蛋白来源于中慢生型天山根瘤菌(Mesorhizobium tianshanense),是Lys R转录调控蛋白家族中的一员,它可以响应宿主植物释放的抗代谢物-刀豆氨酸,激活外运蛋白msiA编码基因的转录表达。通过构建MsiR突变文库,筛选得到了7个MsiR组成型突变蛋白,L166P、A147V、P83L、A278T组成型突变蛋白丧失了对刀豆氨酸的响应,在没有刀豆氨酸时的荧光值为800左右;A147T、E59G组成型突变蛋白仍然可以响应刀豆氨酸的诱导信号,添加刀豆氨酸时荧光值是未添加时的1.7倍。通过蛋白同源建模分析了组成型突变的氨基酸残基在MsiR蛋白上的空间分布及其对MsiR蛋白调控功能可能的影响。组成型突变蛋白的研究对进一步揭示LysR家族蛋白转录调控的机理有重要意义。

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)中两个gcvA基因的鉴定及其特性

GcvA蛋白是LysR转录因子家族成员,在大肠杆菌(Escherichia coli)中,它激活编码裂解甘氨酸酶系(GCV)操纵子(gcvTHP)的表达,这一过程受甘氨酸诱导.在以前的工作中,我们分别突变了苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)中90个LysR家族转录因子,并鉴定了突变株的表型.本研究证明了苜蓿中华根瘤菌基因组中存在2个gcvA基因gcvA1和gcvA2;苜蓿中华根瘤菌gcvTHP操纵子的充分激活需要它们的同时存在.gcvA1对gcvTHP操纵子的激活需要甘氨酸诱导,而gcvA2对gcvTHP操纵子的激活则不需要甘氨酸诱导,推测苜蓿中华根瘤菌中gcvTHP表达的调控机制与大肠杆菌中的不同.进化分析显示,很多原细菌中都存在GcvA蛋白,而苜蓿中华根瘤菌的GcvA1和GcvA2与大肠杆菌的GcvA的亲缘关系很远,这也许可以解释它们gcvTHP表达调控模式的不同.研究结果为LysR基因家族的功能提供了新的线索.