miR-26a-5p调控PTEN/PI3K/Akt信号通路对高糖诱导视网膜Müller细胞活化及凋亡的影响

目的检测微小RNA-26a-5p(microRNA-26a-5p,miR-26a-5p)对PTEN/PI3K/Akt信号通路及高糖刺激的视网膜Müller细胞凋亡的影响,探讨糖尿病视网膜神经损伤的潜在机制。方法采用不同浓度的葡萄糖刺激视网膜Müller细胞构建糖尿病视网膜神经损伤模型,采用CCK-8及流式细胞仪观察细胞增殖及凋亡情况,细胞转染过表达miR-26a-5p模拟物,Real-time PCR检测miR-26a-5p、PTEN、PI3K、Akt的表达情况,ELISA测定细胞上清液中IL-1β及IL-6的水平,采用Graphpad 8.0软件处理数据。结果高糖刺激视网膜Müller细胞生长活跃,与对照组相比,50 mmol/L高糖刺激Müller细胞活力在12 h、24 h时逐渐增加,48 h时活力减弱,细胞凋亡增加,组间差异有统计学意义(P<0.05)。高糖刺激后视网膜Müller细胞中miR-26a-5p水平下降,PTEN的表达显著升高,PI3K及Akt水平下降,IL-1β及IL-6的水平明显升高,过表达miR-26a-5p后,PTEN水平降低,PI3K/Akt及炎性因子降低,细胞凋亡减少(P<0.01)。结论miR-26a-5p通过调控PTEN/PI3K/Akt的表达,影响炎症因子释放,减轻高糖诱导的视网膜Müller细胞凋亡。

视网膜再生中调控Müller细胞重编程的表观遗传修饰和微环境因素研究进展

[背景]Müller细胞(Müller glia,MG)重编程是视网膜再生领域的研究热点.与斑马鱼(Danio rerio)不同,哺乳动物视网膜损伤后MG丧失再生视网膜能力,发生反应性胶质化产生胶质瘢痕,导致哺乳动物MG重编程再生视网膜能力丧失的分子机制仍存在许多不清楚之处.[进展]随着干细胞理论和研究方法的不断进步,越来越多研究利用单细胞测序等技术从转录、表观遗传修饰、细胞外微环境等多层次深入挖掘视网膜再生中MG重编程的调控机制,以期实现哺乳动物的视网膜再生.本文总结了不同物种中已发现的影响MG重编程能力差异的关键分子,着重关注表观遗传修饰和微环境因素.[展望]视网膜再生中MG重编程是受细胞内外多种因素协同调控的复杂过程.对斑马鱼和哺乳动物视网膜再生中MG重编程影响因素进行详细的对比分析,将有助于突破哺乳动物视网膜再生瓶颈,为开发有临床转化潜力的疗法提供新的途径.

Müller细胞在常见眼底疾病中的研究进展

神经胶质细胞在维持中枢神经系统稳态方面发挥关键作用,Müller细胞作为视网膜中主要神经胶质细胞,在维持视网膜结构和功能正常方面有重要作用。Müller细胞的损伤会导致视网膜功能障碍。近年来许多研究表明视网膜功能是否正常很大程度上取决于Müller细胞。本文综述了近五年来Müller细胞在常见的眼底疾病中的作用及相关机制,以期深入了解Müller细胞在常见的眼底疾病中的影响与价值,为眼底疾病发病机制的研究、筛查、诊断、及预防提供新思路。

Müller细胞胶质间质转化在视网膜纤维化疾病中的作用

胶质细胞间质转化(GMT)指胶质细胞在各种因素刺激下逐渐获得间质细胞表型和特征的生物学过程,与视网膜纤维化疾病密切相关。Müller细胞是视网膜上最主要的大胶质细胞,在受到各种病理因素刺激时被激活并发生转分化。目前,已有研究表明,Müller细胞GMT与糖尿病视网膜病变、特发性黄斑前膜(iERM)、年龄相关性黄斑变性(ARMD)、增生性玻璃体视网膜病变(PVR)等多种疾病密切相关。尽管GMT相关调控机制尚不完全明确,但其作为一个潜在的干预靶点,具有良好的研究前景。了解Müller细胞GMT在视网膜疾病中的研究进展,能够为多种视网膜疾病的早期诊断和治疗提供新思路,对于全面揭示细胞转型家族在视网膜疾病中的交互作用具有重要的临床和科学意义。

基于NF-κB/NLRP3通路的芍药苷对缺氧诱导视网膜Müller细胞的影响

目的观察芍药苷对缺氧诱导视网膜Müller细胞的保护作用,探讨其作用机制。方法将rMC-1细胞分为对照组、模型组和芍药苷高、低浓度组,以1200、600μmol/L芍药苷干预缺氧条件下的rMC-1细胞,CCK8检测细胞活力,ELISA检测上清液血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素(IL)-1β含量,Western blot检测细胞核因子(NF)-κB p65、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、半胱氨酸蛋白酶-1前体(pro-Caspase-1)蛋白表达,RT-PCR检测IL-1β、VEGF、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1基因表达。结果与对照组比较,模型组rMC-1细胞活力显著降低,上清液VEGF、IL-1β含量显著增加,细胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白表达显著升高,IL-1β、VEGF、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1基因表达显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.001);与模型组比较,芍药苷高、低浓度组rMC-1细胞活力显著升高,上清液VEGF、IL-1β含量显著减少,芍药苷高浓度组细胞NF-κB p65、NLRP3、ASC、pro-Caspase-1蛋白表达显著降低,IL-1β、VEGF、NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1基因表达显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。结论芍药苷可促进视网膜Müller细胞rMC-1增殖,抑制缺氧诱导的VEGF和IL-1β分泌,其机制可能与抑制NF-κB/NLRP3通路有关。

加味桃红四物汤对视网膜Müller细胞缺氧损伤的保护作用

目的:探讨加味桃红四物汤(MTSD)对视网膜Müller细胞rMC-1缺氧损伤的保护作用。方法:用加味桃红四物汤含药血清干预缺氧条件下rMC-1细胞,随机分为正常对照组(21%O_(2))、缺氧模型组(1%O_(2))、含药血清低(1%O_(2)+5%含药血清)、中(1%O_(2)+10%含药血清)、高剂量组(1%O_(2)+15%含药血清),CCK-8法检测细胞的活力,ELISA法检测血管内皮生长因子(VEGF)和色素上皮衍生因子(PEDF)分泌,Western blot检测磷酸化转录激活因子3(p-STAT3)、转录激活因子3(STAT3)和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的蛋白表达,Real time PCR检测VEGF、PEDF、STAT3和HIF-1α的基因表达。结果:在1%O_(2)条件下培养48h,rMC-1细胞活力较正常对照组明显受到抑制(P<0.05),加味桃红四物汤含药血清低、中剂量组均可以改善rMC-1细胞缺氧48h的细胞存活率(P<0.05),而高剂量组无改善作用(P>0.05)。加味桃红四物汤含药血清低、中剂量组均可减少缺氧条件下rMC-1细胞上清液VEGF的蛋白表达量(P<0.05),但不能增加PEDF的蛋白含量(P>0.05),对p-STAT3和HIF-1α在蛋白水平均有下调作用(P<0.05),且低剂量组抑制作用优于中剂量(P<0.05)。加味桃红四物汤含药血清中剂量组对缺氧后rMC-1细胞STAT3的蛋白表达有上调作用(P<0.05)。加味桃红四物汤含药血清低、中剂量组对缺氧后rMC-1细胞VEGF基因表达均有下调作用(P<0.05),对PEDF基因表达均有上调作用(P<0.05),且低剂量组优于中剂量(P<0.05);并且加味桃红四物汤含药血清低剂量可下调缺氧后STAT3和HIF-1α的基因表达(P<0.05)。结论:加味桃红四物汤含药血清可能通过抑制STAT3/HIF-1α通路,下调缺氧诱导的视网膜Müller细胞rMC-1的VEGF蛋白和基因表达,上调PEDF基因表达,减轻该细胞的缺氧损伤。

视网膜Müller细胞重编程研究进展

视网膜退行性疾病导致的失明严重影响人类健康。哺乳动物视网膜损伤后无法自我修复,而斑马鱼的视网膜具有较强的再生能力,能再生所有类型的视网膜神经元并恢复视觉。斑马鱼的视网膜再生依赖于一种神经胶质细胞——Müller细胞。斑马鱼视网膜损伤后Müller细胞重编程并增殖产生祖细胞,后者进一步分化为新生的视网膜神经元。近年来,基于Müller细胞的视网膜再生研究取得了许多重要进展。我们就斑马鱼视网膜再生的机制和哺乳动物Müller细胞重编程的研究进展做一综述。

牛磺酸对高糖培养下视网膜Mü ller细胞GFAP和TAUT表达的影响

目的:通过检测高糖培养条件下视网膜Müller细胞神经纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)和牛磺酸转运蛋白(taurine transporter,TAUT)的表达变化,观察葡萄糖对Müller细胞牛磺酸(taurine)转运功能的影响,探讨牛磺酸对早期糖尿病视网膜病(DR)可能的保护作用。方法:高糖培养大鼠视网膜Mǜller细胞,用免疫细胞荧光化学双染色、Western blotting技术检测不同浓度牛磺酸干预下Müller细胞GFAP及TAUT的蛋白表达。结果:高糖可引起Müller细胞GFAP表达增强,TAUT表达减弱;牛磺酸可减弱高糖引起的Müller细胞GFAP表达增强,TAUT在0．1mmol/L～10mmol/L的牛磺酸干预后表达增强。结论:牛磺酸可以抑制高糖导致的Müller细胞功能改变。

改良的人视网膜Muller细胞的原代培养方法与鉴定

背景视网膜Muller细胞是视网膜重要的胶质细胞，也是视网膜干细胞的来源之一，研究Muller细胞的生物学行为对研究视网膜的各种生理病理过程和视网膜干细胞治疗研究具有重要意义，而建立稳定的视网膜Muller细胞培养体系是相关研究的基础。目的优化分离培养和纯化人视网膜Muller细胞的方法，为相关的实验研究提供良好优质的Muller细胞来源。方法分离人供体眼视网膜组织，然后将剪碎的视网膜组织置入质量分数0．25％胰蛋白酶＋100U透明质酸酶混合溶液中进行消化，添加含体积分数10％胎牛血清的DMEM／F12培养液1～2ml终止消化，然后加入含体积分数20％胎牛血清的RPMI1640培养液培养72h，行半量换液，再以含10％胎牛血清的培养液进行传代。光学显微镜下根据细胞的形态特征进行细胞鉴定，并分别采用免疫荧光技术和免疫组织化学法检测胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和Muller细胞特异性标志物谷氨酰胺合成酶（GS）的表达，对培养的细胞进行鉴定。结果应用0．25％胰蛋白酶＋100U（商品单位）透明质酸酶的混合酶消化法可成功获取人视网膜Muller细胞，原代培养后24h细胞贴壁，培养后9—10d细胞融合。培养的细胞胞体呈长圆形，细胞质丰富，部分细胞体两端锥状长突起，末端膨隆，细胞核大。传代后的细胞胞体大，呈扁平多角形，符合Muller细胞的形态。细胞免疫组织化学和免疫荧光技术检测显示95％以上的细胞中GFAP呈阳性表达，90％以上的细胞中GS呈强阳性表达。结论应用透明质酸酶和胰蛋白酶混合液消化法可以成功分离人视网膜Muller细胞，分别用含20％胎牛血清和含10％胎牛血清的RPM11640培养液培养和传代的人视网膜Muller细胞产量高且纯度好。

牛磺酸对高糖刺激Mller细胞VEGF和TauT表达的影响

目的通过检测高糖和牛磺酸培养对大鼠视网膜Mller细胞中血管内皮细胞生长因子(vascular en-dothelial growth factor,VEGF)和牛磺酸转运蛋白(taurine transporter,TauT)表达的影响,探讨牛磺酸保护糖尿病引起视网膜损伤的机制。方法实验分6组,分别是正常对照组、牛磺酸对照组、高糖模型组、低、中、高剂量牛磺酸处理高糖组。用免疫细胞荧光双标鉴定Mller细胞,RT-PCR和免疫细胞荧光双标检测Mller细胞中VEGF和TauT的表达。结果体外25mmol/L高糖培养使Mller细胞VEGF mRNA及蛋白表达增加。10mmol/L牛磺酸可有效抑制高糖诱导的VEGF上调表达(P<0.05);高糖诱导Mller细胞中TauT表达抑制,引起TauTmR-NA及蛋白表达明显下降。牛磺酸干预可上调Mller细胞中TauT的表达(P<0.05),提高细胞内外牛磺酸的转运能力。结论体外高糖培养诱导Mller细胞VEGF表达增加,TauT表达下降。牛磺酸通过降低VEGF表达、提高牛磺酸转运能力达到保护视网膜的作用。该实验结果可为牛磺酸用于糖尿病早期视网膜病变的防治提供重要的实验依据。

Trim9调控视网膜Müller细胞向神经节细胞定向分化

目的:青光眼是不可逆性致盲性眼病的主要病因,目前尚无有效疗法逆转青光眼的视觉系统损害。最近发现干细胞疗法有望使受损的视网膜神经元修复和再生,但是在干细胞来源方面仍然存在较大挑战。本研究探寻一种将视网膜Müller细胞去分化为视网膜干细胞,进一步高效定向分化为视网膜神经节细胞的方案,以期为青光眼的干细胞治疗提供新的细胞获取途径。方法:用表皮细胞生长因子和成纤维细胞生长因子2诱导大鼠视网膜Müller细胞去分化为视网膜干细胞。构建Trim9过表达慢病毒(PGC-FU-Trim9-GFP),感染由Müller细胞诱导去分化而来的视网膜干细胞,通过荧光显微镜观察和流式细胞术评估病毒感染效率。用视黄酸和脑源性神经营养因子处理过表达或未过表达Trim9的视网膜干细胞以诱导其分化为神经元和神经胶质细胞。采用免疫荧光、PCR/real-time RT-PCR和蛋白质印迹法检测各细胞标志物(GLAST、GS、rhodopsin、PKC、HPC-1、Calbindin、Thy1.1、Brn-3b、Nestin、Pax6)的表达。结果:表皮细胞生长因子和成纤维细胞生长因子2处理后的大鼠视网膜Müller细胞表达视网膜干细胞标志物Nestin和Pax6。视黄酸和脑源性神经营养因子处理后的过表达Trim9的视网膜干细胞Thy1.1阳性细胞明显增多,表明其定向分化为视网膜神经节细胞。结论:本研究成功将大鼠视网膜Müller细胞去分化为视网膜干细胞,并发现Trim9可有效促进由视网膜Müller细胞去分化而来的视网膜干细胞定向分化为视网膜神经节细胞。

高糖培养的视网膜Muller细胞中embelin对VEGF蛋白质表达的抑制作用

目的研究高糖培养的视网膜Müller细胞中embelin对血管内皮生长因子(VEGF)蛋白质表达的调控作用。方法原代培养的大鼠视网膜Müller细胞在不同糖浓度的培养液中培养,加入X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的特异性抑制剂emblin培养72 h后,利用Western印迹技术检测细胞内VEGF蛋白质的表达情况。结果高糖条件下,在视网膜Müller细胞中VEGF蛋白质表达上调。并且,XIAP的抑制剂emblin加入高糖培养环境后VEGF蛋白质表达下降。结论 XIAP的特异性抑制剂emblin对糖尿病性视网膜病变中VEGF引起的新生血管具有潜在治疗作用。

艳山姜挥发油调控CaMKⅡ信号改善糖尿病诱导视网膜Müller细胞自噬障碍

目的探讨艳山姜挥发油(EOFAZ)对糖尿病诱导视网膜Müller细胞功能障碍的保护作用及机制。方法视网膜Müller细胞使用不同剂量的EOFAZ进行预处理1 h后,采用高糖(30 mmol·L^(-1))孵育48 h,Western blot法检测细胞中自噬信号Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白的表达水平;qRT-PCR分析细胞中P62 mRNA、Beclin1 mRNA的转录水平,免疫荧光实验分析LC3Ⅱ/Ⅰ、P62的表达。并进一步使用钙离子螯合剂BAPTA-AM及CaMKⅡ特异性抑制剂KN93孵育细胞,检测自噬信号LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、P62蛋白表达水平。使用自噬抑制剂氯喹(CQ)孵育细胞,检测细胞中CaMKⅡ及自噬信号LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白的表达。结果与高糖组相比,EOFAZ可明显上调Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62的表达水平;使用BAPTA-AM及KN93孵育细胞与EOFAZ的作用类似。同时观察到EOFAZ与BAPTA-AM或KN93联合应用后,与EOFAZ单独作用的结果无明显差异。当EOFAZ与CQ共同孵育细胞后,EOFAZ对自噬相关蛋白下调的改善作用可被抑制,对CaMKⅡ的磷酸化水平无明显影响。结论EOFAZ对高糖诱导的视网膜Müller细胞自噬障碍具有明显的改善作用,其作用可能是通过抑制CaMKⅡ信号发挥的。

神经胶质成熟因子-β诱导糖尿病大鼠视网膜Müller细胞炎症反应的机制研究

目的 研究神经胶质成熟因子-β(GMFB)对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞活化的作用及相关机制。方法SPF级雄性SD大鼠60只,采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ,55 mg/kg)制备糖尿病模型后分为STZ组、STZ+AAVGMFB组和STZ+AAV-GMFB+K252a组,每组15只。另取15只正常大鼠作为CON组。STZ+AAV-GMFB组和STZ+AAV-GMFB+K252a组大鼠于成模8周后玻璃体腔单次注射AAV-GMFB腺病毒载体5μL。STZ+AAV-GMFB+K252a组在注射腺病毒基础上给予腹腔注射25μg/(kg·d)的K252a。12周后,免疫荧光检测GMFB在Müller细胞中的表达,免疫组织化学染色检测视网膜胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,酶联免疫吸附试验检测视网膜炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6的表达,Western blot检测GMFB、脑源性神经营养因子(BDNF)及磷酸化酪氨酸激酶受体B(p-TrkB)蛋白相对表达水平。HE染色检测视网膜病理改变。结果 GMFB在Müller细胞中大量表达。与CON组比较,STZ组GMFB、GFAP表达及TNF-α、IL-1β、IL-6水平增加,BDNF、p-TrkB蛋白表达减少,视网膜神经节细胞(RGC)排列紊乱,数量减少;与STZ组比较,STZ+AAV-GMFB组GMFB、GFAP表达及TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低,BDNF、p-TrkB蛋白表达增加,RGC排列整齐,数量增加。TrkB抑制剂K252a能大部分逆转AAVGMFB的保护作用。结论 糖尿病大鼠视网膜GMFB表达增加,诱导了Müller细胞活化,加重了炎症反应,该作用与抑制BDNF/TrkB信号通路有关。

脂多糖对小鼠视网膜Müller细胞和小胶质细胞共培养体系中炎症因子水平的影响及其机制

目的:观察脂多糖(LPS)诱导小鼠视网膜单独培养Müller细胞和Müller细胞与小胶质细胞共培养2种体系中的炎症反应,阐明Müller细胞与小胶质细胞的相互作用机制。方法:培养Müller细胞QMMuC-1和小胶质细胞BV2,免疫荧光染色方法观察2种细胞形态表现。实验分为单独培养对照组[QMMuC-1细胞单独培养,采用磷酸盐(PBS)缓冲液处理]、共培养对照组(QMMuC-1细胞和BV2细胞共培养,细胞比例1∶1,采用PBS缓冲液处理)、单独培养实验组(QMMuC-1细胞单独培养,采用10 mg·L^(-1)LPS处理)和共培养实验组(QMMuC-1细胞和BV2细胞共培养,采用10 mg·L^(-1)LPS处理)。采用免疫荧光染色法观察各组细胞中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)水平,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组QMMuC-1细胞中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA表达水平。结果:QMMuC-1细胞中神经胶质细胞标志物谷氨酰胺合成酶(GS)和GFAP阳性,BV2细胞中小胶质细胞标志物离子钙接头蛋白分子1(Iba-1)阳性。与单独培养对照组比较,单独培养实验组QMMuC-1细胞中GFAP水平升高1.7倍(P=0.005);与共培养对照组比较,共培养实验组QMMuC-1细胞中GFAP水平升高2倍(P=0.003),细胞形态逐渐变成梭形;与单独培养实验组比较,共培养实验组QMMuC-1细胞中GFAP水平升高1.4倍(P=0.0006),大部分细胞呈梭形。与单独培养对照组比较,单独培养实验组QMMuC-1细胞中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达水平升高,但差异无统计学意义(P>0.05);与共培养对照组比较,共培养实验组QMMuC-1细胞中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达水平升高(P<0.05);与单独培养实验组比较,共培养实验组QMMuC-1细胞中IL-1β和TNF-αmRNA表达水平升高(P<0.05)。结论:LPS可能通过诱导小胶质细胞激活后释放炎症因子作用于Müller细胞,并加剧了Müller细胞的炎症反应。

化瘀散结片对实验性增生性玻璃体视网膜病变muller细胞胶原纤维酸性蛋白的影响

目的观察化瘀散结片对DispaseI诱导的实验性增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）兔视网膜组织胶原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表达的影响。方法通过免疫组织化学法检测DispaseI诱导的PVR兔视网膜组织中的GFAP水平的表达情况，观察化瘀散结片对其影响。结果治疗28天后阴性对照组GFAP表达水平高于空白对照组，有极显著差异（P〈0．01），阴性对照组与阳性对照组比较有显著差异（P〈0．01），与化瘀散结片高、中剂量治疗组比较有极显著差异（P〈0．01），而与低剂量治疗组比较无差异（P〉0．05）。提示化瘀散结片能降低PVR兔GFAP表达水平。结论化瘀散结片能减少GFAP表达水平，可抑制maller细胞增殖，减轻对视网膜的过度损伤反应，从而抑制PVR的进一步发展。

紫杉醇对视网膜Müller细胞的影响

目的:探究抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)对Müller细胞增殖、凋亡、细胞周期、细胞形态与相关蛋白表达的影响以研究其对视网膜的潜在毒性。方法:体外培养Müller细胞并分成两组:对照组(正常培养基)、加药物组(PTX)。不同浓度PTX(0.005、0.05、0.5、5mg/L)处理视网膜Müller细胞12、24、36、48、72h,CCK8法检测不同浓度PTX、刺激不同时间对Müller细胞增殖的影响;流式细胞术检测不同浓度PTX对Müller细胞凋亡的影响及细胞周期的阻滞作用;免疫荧光观察Müller细胞的形态变化;Western blot及qRT-PCR检测PTX对Müller细胞凋亡相关蛋白表达以及水通道蛋白的影响。结果:PTX可以抑制体外培养的Müller细胞增殖能力,药物浓度越高,刺激时间越久,细胞增殖能力越弱;此外,PTX还能促进Müller细胞的凋亡,越高的药物浓度和更长的刺激时间会导致更高的细胞凋亡率;流式细胞检测细胞周期表明,PTX将Müller细胞阻滞于G2-M期。而细胞形态也由形态清晰、细长纤维状的正常形态趋于圆形,且细胞数量显著减少;药物处理后的细胞炎症因子较对照组出现一过性的高表达,但这种高表达可通过停止药物刺激缓解;药物处理后的细胞中的CA XIV蛋白表达较对照组上调,VEGF的表达较对照组下调(P<0.05);PTX组中炎症因子的表达较对照组显著升高(P<0.05);表明PTX会破坏视网膜屏障功能。结论:PTX抑制Müller细胞的增殖、促进Müller细胞的凋亡,且细胞的增殖、凋亡与刺激时间和药物浓度相关;此外,PTX将Müller细胞周期阻滞于G2-M期,并会改变细胞形态,使细胞炎症因子出现短暂性的高表达,对视网膜屏障产生影响。揭示抗肿瘤药物PTX对视网膜具有潜在毒性。

神经胶质成熟因子-β对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞活化的影响及可能机制

目的 探讨神经胶质成熟因子-β(GMFB)对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞活化的影响及可能作用机制。方法 采用腹腔注射链脲佐菌素(55 mg·kg-1)的方法制备雄性SD大鼠的糖尿病模型,并按照随机数字表法分成STZ组、STZ+AAV-GMFB组、STZ+AAV-GMFB+colivelin组,每组15只。另取15只正常大鼠作为CON组。STZ+AAV-GMFB组、STZ+AAV-GMFB+colivelin组大鼠于成模8周后玻璃体内单次注射AAV-GMFB腺病毒载体5μL;STZ+AAV-GMFB+colivelin组大鼠在注射腺病毒基础上给予腹腔注射colivelin(2 mg·kg·d-1),共注射4周;CON组和STZ组大鼠腹腔注射2 mL生理盐水。成模12周后,免疫荧光染色检测GMFB在Müller细胞中的表达,免疫组织化学染色检测GFAP的表达,ELISA检测视网膜中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白含量,Western blot检测视网膜中GMFB、p-JAK2和p-STAT3蛋白相对表达。结果 GMFB在STZ组Müller细胞中与GS大量共定位。与CON组相比,STZ组大鼠视网膜中GFAP表达增加,TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白含量及GMFB、p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量均明显增加(均为P<0.05),视网膜神经节细胞排列紊乱,数量明显减少;与STZ组相比,STZ+AAV-GMFB组大鼠视网膜中GFAP表达明显降低,TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白含量及GMFB、p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量均明显降低(均为P<0.05),视网膜神经节细胞排列整齐,数量明显增加。STZ+AAV-GMFB+colivelin组能大部分逆转AAV-GMFB的保护作用。结论 敲减GMFB基因能抑制糖尿病大鼠视网膜Müller细胞的活化,其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路有关。

高糖条件下沉默LRP6通过Wnt/β-catenin途径抑制大鼠视网膜Müller细胞的自噬与凋亡

目的:探究在高糖作用下大鼠视网膜Müller细胞中低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的表达及其对高糖条件诱导的Müller细胞自噬与凋亡的作用和机制。方法:体外培养大鼠视网膜Müller细胞,采用RT-PCR与Western blotting检测高糖条件下Müller细胞中LRP6 mRNA和蛋白的表达水平;利用siRNA干扰技术沉默Müller细胞中的LRP6,并分别在葡萄糖浓度为5.6 mmol·L^(-1)(NG)与35 mmol·L^(-1)的DMEM培养液(HG)中进行培养,按处理方式的不同将Müller细胞分为葡萄糖浓度为5.6 mmol·L^(-1)的DMEM培养的正常葡萄糖组(NG组)、葡萄糖浓度为35 mmol·L^(-1)的DMEM培养的转染si-NC组(HG+si-NC组)和si-LRP6的Müller细胞组(HG+si-LRP6组);采用Western blotting检测各组Müller细胞中自噬相关蛋白P62的表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ之值、Beclin1与Atg12-Atg5复合体的表达;共聚焦显微镜观察RFP-GFP-LC3串联质粒转染后各组Müller细胞中自噬通量的变化;TUNEL染色检测各组Müller细胞的凋亡率,Western blotting法检测细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax与cleaved Caspase-3及Wnt/β-catenin途径中β-catenin蛋白的表达。结果:与NG组相比,HG组Müller细胞中LRP6 mRNA和蛋白的表达水平明显增高(P<0.01);与NG组比较,HG+si-NC组、HG+si-LRP6组Müller细胞中除P62和Bcl-2蛋白表达显著降低外(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ之值、Beclin1与Atg12-Atg5复合体、细胞中自噬通量、TUNEL阳性细胞率及细胞中Bad、cleaved Caspase-3蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);而与HG+si-NC组比较,HG+si-LRP6组中除P62、Bcl-2蛋白明显升高外(P<0.05),其他检测指标均显著降低;此外,与NG组比较,HG+si-NC组中β-catenin蛋白表达显著升高(P<0.05),而HG+si-LRP6组明显降低(P<0.05);其中与HG+si-NC组相比,HG+si-LRP6组中β-catenin蛋白的降低趋势更为显著(P<0.01)。结论:高糖可促进Müller细胞中LRP6的表达,采用siRNA干扰技术沉默细胞中LRP6表达可能通过下调Wnt/β-catenin途径抑制高糖诱导的Müller细胞自噬,并减少细胞的凋亡。

过表达miR-132对糖尿病视网膜病变Müller细胞的保护作用及相关机制

目的研究过表达微小RNA(miR)-132对糖尿病视网膜病变Müller细胞的保护作用及相关机制。方法选取10只SPF级大鼠,构建糖尿病视网膜病变模型,建模成功后分离出视网膜Müller细胞,做细胞培养。将Müller细胞分为对照组、沉默组、过表达组,对照组不进行任何处理,沉默组做miR-132沉默(miR-132 inhibitor)转染,过表达组做miR-132过表达(miR-132 mimic)转染。鉴定miR-132转染效率,对比细胞存活、凋亡情况,分析细胞肿瘤抑制因子(PTEN)/磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路蛋白表达情况。结果与对照组相比,沉默组miR-132表达明显降低,过表达组miR-132表达明显升高(P<0.05)。与沉默组相比,过表达组各时间点细胞存活率明显升高,细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。与沉默组相比,过表达组p-PTEN表达量明显降低,p-PI3K、p-AKT、p-促凋亡蛋白(Bad)、Bcl-2表达量明显升高(P<0.05)。结论过表达miR-132可经抑制糖尿病视网膜病变Müller细胞凋亡,增加存活率而发挥保护作用,其作用机制可能与调控PTEN/PI3K/AKT通路相关。