银杏叶提取物对体外培养的人Müller细胞氧化损伤的保护作用

背景 氧化应激是视网膜损伤中重要的病理生理过程,探讨保护视网膜免受氧化应激损伤的方法具有重要的临床意义.研究证实银杏叶提取物具有抗氧化、抗凋亡、抗血栓、抗炎等多种功能,但其对人Müller细胞的抗氧化作用研究较少. 目的 研究银杏叶提取物（EGb）对氧化剂三氧化二砷（As2O3）诱导的人Müller细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制. 方法 人Müller细胞株用含体积分数10％胎牛血清（FBS）、2μmol/L谷氨酰胺和质量分数1％青链霉素双抗的DMEM/F12培养液进行培养和传代,取对数生长期的Müller细胞分为5个组,阴性对照组细胞采用常规培养法进行培养,在培养基中加入终质量浓度为5 mg/L的As2 O3处理细胞24 h以建立细胞氧化损伤模型,然后将5、10和20 mg/L EGb分别加入模型细胞培养液中作用24 h,采用MTT法检测各组细胞的活力;采用CM-H2DCFDA荧光探针法测定各组细胞活性氧簇（ROS）含量;采用逆转录PCR（RT-PCR）法检测细胞中easpase-3 mRNA的相对表达量;采用Western blot法分别检测细胞质和细胞核中Nrf2蛋白的表达. 结果 Müller细胞接种至培养瓶后24 h,倒置显微镜下可见接种细胞贴壁良好,培养6～7d时Müller细胞的细胞体积较大,细胞质丰富,呈镶嵌样排列.As2O3处理组部分细胞凋亡,呈卵圆形悬浮在培养液中.MTT法测定结果表明,阴性对照组细胞活力（A值）最高,As2 O3处理组细胞活力最低,而As2O3 ＋5 mg/L EGb组、As2O3＋10 mg/L EGb组和As2O3＋20 mg/L EGb组A值随着EGb质量浓度的增加而逐渐增加,各组间总体比较差异有统计学意义（F=163.57,P=0.00）.阴性对照组细胞中ROS荧光强度最弱,As2O3处理组最强,As2O3 ＋5 mg/L EGb组、As2O3＋10 mg/L EGb组和As2 O3 ＋20 mg/L EGb组细胞中ROS荧光强度值随着EGb质量浓度的升高而逐渐减弱,各组间细胞中ROS荧光强度值的总体比较差异有统计学意义（F=4 013.61,P=0.00）.细胞内caspase-3 mRNA的相对表达量随EGb质量浓度的升高逐渐下降,各组间总体比较差异有统计学意义（F=2 199.72,P=0.00）.各组细胞质中Nrf2蛋白的表达比较,差异无统计学意义（F=15.42,P=0.40）;阴性对照组、As2O3处理组及As2O3＋5 mg/L EGb组、As2O3＋ 10 mg/L EGb组和As2 O3 ＋20 mg/L EGb组细胞核Nrf2蛋白表达量（灰度值）分别为100.01±0.04、46.59±0.63、54.51 ±0.62、59.93±0.17和67.60±0.24,总体比较差异有统计学意义（F=7271.72,P=0.00）,其中阴性对照组细胞核Nrf2蛋白表达量最低,而As2O3处理组最高,差异均有统计学意义（均P＜0.05）. 结论 EGb以剂量依赖的方式减轻体外培养的人Müller细胞的氧化应激损伤,其机制与抗氧化和抗凋亡作用有关,其减轻Müller细胞氧化应激损伤的调控主要发生在细胞核。

Müller细胞在视网膜糖酵解作用机制中的研究进展

糖酵解是生物通过在细胞内对糖的分解代谢获取部分能量的一种途径,视网膜的病理性改变多与能量代谢相关,视网膜Müller细胞是正常视网膜功能及几乎所有形式的视网膜损伤和疾病的参与者,Müller细胞在调控视网膜病变的病理过程中与糖酵解前体代谢产物之间有着密切关系。本文就视网膜及其Müller细胞与糖酵解前体代谢产物的作用机制进行归纳总结,为视网膜病变的治疗提供新的研究思路。

载脂蛋白M对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞中相关炎性因子表达的抑制作用

目的观察高糖培养环境下人视网膜血管内皮细胞（HRECs）中载脂蛋白M（ApoM）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和单核细胞趋化因子-1（MCP-1）表达的变化，探讨ApoM过表达对高糖诱导的HRECs中TNF-α和MCP-1表达的抑制作用。方法采用含体积分数10%胎牛血清（FBS）和5.5 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养基培养HRECs后分为6个组。正常对照组细胞进行常规培养，高糖组细胞用含30 mmol/L D-葡萄糖的高糖培养基进行培养，ApoM过表达组用载有ApoM序列的慢病毒载体感染常规培养的细胞，空载组用无ApoM序列的慢病毒载体感染常规培养的细胞，空载＋高糖组用高糖培养基培养空载体感染的细胞，ApoM过表达＋高糖组用高糖培养基培养ApoM感染的细胞。采用实时荧光定量PCR法检测细胞中ApoM、TNF-α和MCP-1 mRNA相对表达量；采用Western blot法检测细胞中ApoM蛋白相对表达量。结果实时荧光定量PCR法检测显示，高糖组细胞中ApoM、TNF-α和MCP-1 mRNA相对表达量明显高于正常对照组，差异均有统计学意义（t＝5.517、3.295、2.555，均P〈0.05）。HRECs感染慢病毒后生长良好，ApoM过表达组细胞中ApoM mRNA相对表达量为236.400±39.270，明显高于空载组的1.000±0.153，差异有统计学意义（t＝5.995，P〈0.01），空载组细胞中未见ApoM蛋白表达条带，ApoM过表达组蛋白表达条带较强。正常培养基和高糖培养基培养后24 h，ApoM过表达组中ApoM蛋白相对表达量分别为1.000±0.249和2.978±0.285，差异有统计学意义（t＝5.056，P〈0.01）。空载组、空载＋高糖组、ApoM过表达组、ApoM过表达＋高糖组细胞中TNF-α和MCP-1 mRNA相对表达量的总体比较差异均有统计学意义（F＝5.966，P＝0.026；F＝14.410，P＝0.002），ApoM过表达＋高糖组细胞中TNF-α mRNA和MCP-1 mRNA相对表达量明显低于空载＋高糖组，差异均有统计学意义（P＝0.017、0.004）。 结论高糖培养早期可上调HRECs中ApoM、MCP-1和TNF-α的表达，过表达ApoM能够抑制高糖诱导的MCP-1和TNF-α表达的上调。

肾上腺髓质素对于喉癌细胞的增殖作用

目的观察肾上腺髓质素(adrenomedullin,ADM)对于喉癌细胞系Hep-2的促进增殖作用。方法采用氚胸腺嘧啶(H3-thymidine,H3-TDR)掺入方法观察不同药物作用下ADM对于喉癌细胞系Hep-2增殖的影响。结果在ADM浓度为1×10-10、1×10-9、1×10-8mol/L时均可以显著促进Hep-2细胞增殖(t=-2654.8、P<0.01,t=-1732.3、P<0.01和t=-836.5、P<0.01),三组浓度的ADM促进Hep-2增殖作用差别有显著性(F=18.5,P<0.01),且有剂量依赖性(r=0.9996,P<0.01)。加入ADM受体阻断剂ADM(22-52)Hep-2细胞的H3-TDR掺入量与单纯ADM孵育组掺入量差别有显著(t=2721.5,P>0.05)。Hep-2细胞经ADM孵育后分别加入丝裂素活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(mitogen-acti-vatedproteinkinase/extracellularsignal-regulatedkinase,MAPK/MEK)阻断剂PD098059、蛋白激酶A(proteinkinaseA,PKA)阻断剂H-89、H3-TDR掺入量与单纯ADM刺激组掺入量差别有显著意义(t=2723.8,P<0.01、t=2095.2,P<0.01〉;但加入P38MAPK通路阻断剂SB202190后,H3-TDR掺入量与单纯ADM刺激组差别无显著性。(t=121.83,P>0.05)。结论肾上腺髓质素对于喉癌细胞Hep-2的增殖有促进作用,阻断ADM受体后Hep-2细胞生长受抑制,ADM促进Hep-2细胞生长信号可以通过MEK、PKA通路起作用,未发现p38MAPK参与该作用。

海带硫酸多糖对小鼠腹腔巨噬细胞激活及细胞毒作用的影响

目的:探讨海带硫酸多糖(LPS)对小鼠腹腔巨噬细胞MΦ的激活及细胞毒作用,为研究LPS作用机体抑制S-180细胞生长的作用提供实验依据。方法:小鼠随机分为5组,生理盐水NC为对照组,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ为实验组,分别腹腔注射不同浓度的LPS 20、40、80和120mg/kg·d,连续注射2 d,然后制备腹腔MΦ效应细胞和用传代8 d龄腹水型S-180瘤细胞制备靶细胞,使效:靶之比为5:1,在96孔培养板上进行MΦ细胞毒活性测定。结论:海带硫酸多糖能激活小鼠腹腔巨噬细胞,对S-180肿瘤细胞具有较好的杀伤作用。

TXNIP在高糖诱导的小鼠视网膜Müller细胞自噬中的作用及相关机制

目的:探讨硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)对高糖诱导的小鼠视网膜Müller细胞自噬的影响及其可能机制。方法:采用高糖诱导体外培养的小鼠视网膜Muller细胞,通过RNA干扰降低TXNIP的表达,免疫荧光、Western blot和Real-time PCR检测自噬相关蛋白及丝氨酸/苏氨酸激酶/雷帕霉素靶蛋白(serine/threonine kinase 1/mechanistic target of rapamycin kinase,AKT/m TOR)的表达。结果:高糖诱导的Muller细胞中TXNIP、微管相关蛋白1轻链3α(microtubule associated protein 1 light chain 3 alpha,LC3Ⅱ)、Sequestosome1(p62/SQSTMl)的表达均显著增加(P<0.05);而TXNIP敲降的Muller细胞中自噬相关特征性蛋白(LC3Ⅱ、P62)的表达则显著降低(P<0.05)。结论:TXNIP可能通过AKT/m TOR信号通路来抑制糖尿病性视网膜病变中Müller细胞自噬活性,并引起细胞发生凋亡。

wortmannin对高糖视网膜Müller细胞条件培养基诱导的内皮细胞增殖和迁移的影响

目的 探讨wortmannin抗眼内新生血管形成的可能。方法 采用免疫荧光、流式细胞分析和Boyden小室迁移实验观察高糖视网膜Müller细胞条件培养基(HGMCM)诱导的内皮细胞增殖和迁移的影响。结果 50nmol/Lwortmannin可明显抑制HGMCM诱导的内皮细胞的增殖和迁移,使内皮细胞S期细胞百分率明显下降[ (37 .82±0 .57)%至(21. 91±0 .23)%,P<0 .01],G0 /G1 期细胞百分率显著升高[ (54 .57±1 .19)%至(65. 59±0. 41)%,P<0 .01],G2 /M期细胞增多(P<0 .05)。结论 wortmannin对HGMCM诱导的内皮细胞的增殖和迁移均有抑制作用,提示wortmannin具有抗视网膜新生血管形成的作用。

表皮生长因子受体-TKI和表皮生长因子受体单克隆抗体联合应用治疗表皮生长因子受体T790M突变的继发耐药非小细胞肺癌的疗效

表皮生长因子受体（EGFR）在肺癌中过表达。在调节肿瘤细胞的生长、修复和生存、新生血管生成、侵袭和转移中具有重要的作用，已经成为治疗肺癌的重要靶点之一…。我们考虑由于EGFR·TKI和EGFR单克隆抗体这两类药物作用靶点的不同，而且有研究认为这两种药物联合应用可以提高疗效，因此我们提出了这两类药物联合应用可能会增强T790M突变的耐药非小细胞肺癌的疗效的假设。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导前列腺癌细胞凋亡的研究

目的 研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)对前列腺癌细胞的凋亡诱导作用。方法 10 μg/L～ 10 0 μg/L的TRAIL处理培养的PC 3M细胞 4～ 2 4h后 ,采用Annexin V荧光染色、透射电镜、原位末端转移酶标记技术 (TUNEL)检测肿瘤细胞凋亡 ;流式细胞术和MTT比色检测凋亡率、细胞生长抑制率与TRAIL的时间、浓度依赖关系。结果 10 μg/L～ 10 0 μg/LTRAIL作用 4～ 2 4h ,肿瘤细胞出现典型的凋亡形态学改变 ,随着TRAIL浓度的增加或药物作用时间的延长 ,肿瘤细胞凋亡率也增加 ,为 13 .8%～ 79.6% ,同时细胞生长抑制率出现明显增加 ,药物作用 8h为 7.5 %～ 3 7.9% ,12h为 16.7%～ 87.9% ,2 4h为 3 9.7%～ 97.6%。结论 TRAIL能够迅速和显著地诱导PC 3M细胞凋亡 ,可能成为晚期前列腺癌治疗的新方法。