高糖对体外培养的视网膜Müller细胞活性的影响

背景视网膜Mǖiler细胞具有为视网膜组织提供营养、维持视网膜的正常结构等多种生理功能，研究发现Mǖiler细胞的病变会导致视网膜血管发生相应的改变。探讨高糖对视网膜Mǖiler细胞的影响对于糖尿病视网膜病变（DR）的发病机制研究具有重要意义。目的研究不同浓度的葡萄糖对体外培养的视网膜Mǖiler细胞活性的影响。方法取出生后10d清洁级SD大鼠的视网膜组织，用组织块培养法在含质量分数20％胎牛血清的DMEM培养液中体外原代培养Mǖiler细胞并传代，取第3代细胞用免疫组织化学法对细胞进行鉴定。将不同浓度（5．5、30．0、40．0mmol／L）的葡萄糖加入培养基中培养4d，MTT比色法测定各组波长570nm处Mǖller细胞的吸光度（A570）值，计算各组细胞的相对存活率；采用流式细胞仪检测各组Mǖller细胞的凋亡率。结果培养的细胞贴壁生长，呈长梭形；95％以上细胞神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）反应阳性。MTT比色法检测显示，正常葡萄糖组及30．0mmo／L、40．0mmol／L葡萄糖处理组Mǖller细胞A570值分别为0．24±0．01、0．21±0．03和0．20±0．02，总体差异有统计学意义（F=6．755，P〈0．05）。与正常葡萄糖组比较，30．0mmol／L、40．0mmol／L葡萄糖处理组A570值均明显降低，差异有统计学意义（q=0．645、0．486，P〈0．05）。流式细胞仪检测结果表明，正常葡萄糖组、30．0mmol／L和40．0mmol／L葡萄糖处理组Mǖller细胞凋亡率分别为（26．40±0．25）％、（30．19±0．16）％和（36．23±0．19）％，总体差异有统计学意义（F=294．530，P〈0．05），与正常葡萄糖组比较，30．0mmol／L、40．0mmol／L葡萄糖组凋亡率均明显升高，差异有统计学意义（q=0．754、0．484，P〈0．05）。结论高浓度葡萄糖可抑制视网膜Mǖller细胞的生长并增加其凋亡率，葡萄糖的上述作用呈浓度依赖性。

糖基化终产物对体外培养兔视网膜Müller细胞的影响

目的探讨糖基化终产物(AGEs)对体外培养兔视网膜Müller细胞的影响。方法培养兔视网膜Müller细胞,体外制备AGEs及其对照物,实验分为牛血清白蛋白AGE(AGE-BSA)作用3 d组、AGE-BSA作用9 d组、AGE-BSA对照3 d组、AGE-BSA对照9 d组、空白对照3 d组及空白对照9 d组。采用光镜下观察及流式细胞仪检测AGEs对Müller细胞凋亡发生率的影响。结果AGEs对Müller细胞作用3 d后,与对照组相比,细胞形态和数量无明显变化,无明显细胞凋亡;而作用9 d后,细胞数量明显减少,细胞凋亡率明显增高。结论AGEs可抑制视网膜Müller细胞的生长。

丁基苯酞对过氧化氢诱导下视网膜Mǖller细胞凋亡的影响

目的观察丁基苯酞（NBP）对过氧化氢（H2O2）诱导下视网膜Müller细胞凋亡的保护作用。方法体外培养的人视网膜Müller细胞分为正常对照组、模型组（H2O2组）、实验组（H2O2＋NBP组）。H2O2组、H2O2＋NBP组细胞培养液中加入200 μmol/L H2O2刺激2 h后，H2O2组更换为完全培养基，H2O2＋NBP组更换为含1 μmol/L NBP的完全培养基。正常对照组为常规培养细胞。苏木精-伊红（HE）染色观察各组细胞形态改变；噻唑蓝（MTT）比色法检测NBP作用24、48 h后各组细胞活性；Hoechst33258染色观察各组细胞凋亡情况；LIVE/DEAD细胞活性/细胞毒性试剂盒检测各组细胞生存力；二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）＋内质网（ER）红色荧光探针（ER-Tracker Red）双染色观察各组细胞ER中活性氧（ROS）的表达水平。单因素方差分析联合Dunnett统计学方法进行数据分析。结果HE染色结果显示，H2O2＋NBP组细胞数量较H2O2组增加。MTT比色法检测结果发现，NBP作用24、48 h后，正常对照组与H2O2组、H2O2组与H2O2＋NBP组细胞生存力比较，差异均有统计学意义（t=28.96、3.658、47.58、20.33，P＜0.001、0.022）。Hoechst33258结果显示，H2O2＋NBP组细胞少数细胞核边集呈新月状且细胞核碎裂减少，其余细胞蓝色荧光均匀。LIVE/DEAD细胞活性/细胞毒性试剂盒检测结果显示，H2O2组中呈红色荧光的死亡细胞明显增多，呈绿色荧光的活细胞数量显著减少；H2O2＋NBP组呈绿色荧光的活细胞数量增多，呈红色荧光的死亡细胞减少。DCFH-DA＋ER-Tracker Red双染色结果显示，H2O2组细胞中绿色荧光强度明显增强；H2O2＋NBP组细胞中绿色荧光强度较H2O2组明显降低。结论NBP通过抑制ROS的产生缓解H2O2诱导的人视网膜Müller细胞凋亡。