蛋白激酶A对小鼠受精卵早期发育过程中M期促进因子活性的影响

为研究小鼠体内 1 细胞期受精卵M期蛋白激酶A(PKA)对M期促进因子 (MPF)活性的影响 ,应用PKA激动剂cAMP及热稳定性抑制剂PKI显微注射入 1 细胞期受精卵内 ,观察MPF及PKA活性变化 .未经注射的对照组MPF活性在分裂期增高 ,分裂间期下降 ;而PKA活性在进入分裂期下降 ,分裂间期升高 .cAMP组PKA活性维持高峰值 ,直至注射HCG后 2 8h ,MPF活性高峰延迟 30min出现 ;PKI显微注射组PKA活性低 ,而MPF活性在注射HCG后 2 7 5h即达高峰 ,且维持高峰时间达1 5h .结果表明 ,PKA活性在细胞周期中也呈波动性 ,间期活性高 ,分裂期活性低 ;PKA高活性抑制MPF活性 ,而抑制PKA活性则MPF活性高峰提前出现 .

M期促进因子在唾液腺腺样囊性癌中的表达

目的:研究M期促进因子(MPF)的表达与唾液腺腺样囊性癌(SACC)临床病理特点之间的关系。方法:应用免疫组织化学SP法检测40例SACC组织及40例正常唾液腺组织中MPF的表达。应用Western印迹测定SACC细胞系SACC-83和SACC肺高转移细胞系SACC-LM中MPF的表达。采用SPSS11.5统计软件包,分别应用χ2检验、配对t检验和线性相关分析进行统计学处理。结果:SACC组织中MPF的表达明显升高,与正常唾液腺组织之间存在显著差异(P<0.05)。MPF的表达与SACC的病理类型有关(P<0.05)。体外培养的SACC细胞系SACC-LM中MPF的表达显著高于SACC-83中MPF的表达(P<0.05)。结论:MPF在SACC组织中呈高表达,其表达与SACC的发生密切相关,MPF的异常激活是SACC恶性增殖的原因之一,MPF与SACC的转移能力有关。

小鼠受精卵早期发育过程中M期促进因子的活性变化

目的 :探讨小鼠体内受精卵一细胞期发育到二细胞期过程中 M期促进因子 ( MPF)的活性变化。方法 :利用体内受精方法获得小鼠受精卵 ,以组蛋白 H1为底物 ,以 [γ- 32 P]ATP为磷酸基供体测定 MPF激酶活性。结果 :MPF活性在分裂期升高 ,在分裂间期下降。结论 :MPF活性与小鼠受精卵分裂密切相关。

腺癌及口腔正常组织中 M期促进因子的活性

目的:通过对口腔正常组织与腺癌中M期促进因子(M-phase promoting factor,MPF)的存在状态及活性的比较,探讨MPF与口腔肿瘤的发展及恶性度间的关系.方法:MPF的量及活性测定分析是利用免疫印迹法及Gollicano法.结果:发现MPF的两个亚基cdc2及细胞周期蛋白B(cyclin B)都存在于口腔正常组织及腺癌中,且腺癌中的MPF活性高于正常组织.提示MPF的活性变化可能与肿瘤的恶性度有关.结论:MPF存在于正常组织及腺癌中,肿瘤组织中的量及活性均高于正常组织.蛋白激酶C可激活MPF,在肿瘤组织中有可能蛋白激酶C通过激活MPF,促进肿瘤的增殖.MPF的活性可能与肿瘤的发展及恶性度相关.

小鼠未受精卵和早1-细胞期受精卵中MPF蛋白水平的检测

目的::检测小鼠未受精卵和早1-细胞期受精卵中M期促进因子(MPF)蛋白水平,探讨MPF在早1-细胞期受精卵中的变化.方法:利用超排卵及反复冻融裂解细胞的方法,对卵母细胞和受精卵细胞中MPF的催化亚基Cdc2、调节亚基周期素B进行Western印迹分析.结果:在500个MⅡ卵母细胞和受精卵细胞样品中,可以清楚看到各有一条粉紫色的特异免疫印迹带显示Cdc2,根据凝胶成像及分析系统的Gelworks应用软件分析,得到的强度的相对值分别是100%和约80%.用700个卵细胞进行观察时可以看到MⅡ卵母细胞显示有2条免疫印迹带显示细胞周期素B,其中一条为60～63 kDa,是周期素B;另一条则位于周期素B的下方,约40～45 kDa,且色调偏淡.而受精卵细胞样品在相应的部位则未能见到特异的免疫印迹带.结论:小鼠早1-细胞期受精卵(G1期)中的Cdc2蛋白水平仍保持在相对的较高水平;而细胞周期素B的量显著减少,难以检测.

蛋白激酶CK2β小干扰RNA促进小鼠受精卵早期发育

目的:利用特异性小发夹RNA(siRNA)寡核苷酸片段,研究蛋白激酶CK2调节亚基CK2β对小鼠受精卵早期发育的影响,阐明调控小鼠受精卵早期发育的机制。方法:超排卵获得小鼠1-细胞期受精卵,分别显微注射TE缓冲液、scramble siRNA和CK2βsiRNA,收集卵细胞后用RT-PCR和Western blotting方法检测CK2βsiRNA的干涉效能;相差显微镜观察受精卵的形态变化、计数卵裂率;放射自显影测定M期促进因子(MPF)活性。结果:与TE缓冲液和scramble siRNA组比较,CK2βsiRNA组CK2β的mRNA水平和蛋白表达显著降低(P<0.01),MPF的活性明显升高(P<0.01),在人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射后28.5h达到高峰;受精卵第一次有丝分裂加速,CK2βsiRNA组在hCG注射后28.5h大多数受精卵已经分裂为2-细胞期胚胎;hCG注射后32.0h卵裂率为89.5%,与TE缓冲液和scramble siRNA组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:CK2βsiRNA通过提前激活MPF活性,进而促进小鼠1-细胞期受精卵的发育。

小鼠受精卵早期发育过程中PKA在M/G1期进程中的作用

为研究小鼠体内1-细胞期受精卵蛋白激酶A(PKA)对M/G1期进程的影响,应用热稳定性抑制剂PKI显微注射入1-细胞期受精卵内,观察M期促进因子(MPF)及PKA活性变化以及MPF调节亚基Cyclin B含量情况。发现PKI显微注射后PKA活性低,而MPF活性在hCG后27.5 h即达高峰,较对照组提前30分钟。PKI达一定浓度则MPF活性不下降,出现M/G1阻滞;与此同时Western blotting法显示PKI注射后Cyclin B含量在M末期相当于M中期水平。结果表明,PKI显微注射抑制PKA活性后MPF活性呈高峰值,高浓度PKI显微注射可引起M/G1阻滞,其机制与PKI干扰了Cyclin B降解有关。

口腔肿瘤及正常组织中M期促进因子的活性

目的 通过对口腔正常组织与混合瘤、高分化粘液表皮样癌及颊癌中的M期促进因子(M phasepromotingfactor,MPF)的存在状态及活性的比较 ,探讨MPF与口腔肿瘤的发展及恶性度间的关系。方法 利用免疫印迹法及Gollicano法测定MPF的量并进行活性测定分析。结果 MPF的 2个亚基cdc2及CyclinB都存在于口腔正常组织、混合瘤、高分化粘液表皮样癌及颊癌中 ,且肿瘤组织中的MPF量高于正常组织 ;肿瘤组织中的MPF的活性量高于正常组织。颊癌较正常组织高 6 4% ,提示很可能MPF的活性变化与肿瘤的恶性度有关。结论 MPF存在于正常组织、混合瘤、高分化粘液表皮样癌及颊癌中 ,肿瘤组织中的量及活性均高于正常组织。蛋白激酶C可激活MPF ,在肿瘤组织中蛋白激酶C可能通过激活MPF来促进肿瘤的增殖。MPF的活性可能与肿瘤的发展及恶性度相关。

cAMP-PKA途径在小鼠受精卵卵裂中的作用

目的 :探讨环腺苷酸 蛋白激酶A(cAMP PKA)途径在小鼠受精卵早期卵裂中的变化规律及作用。方法 :动态观察小鼠 1 细胞期受精卵M期cAMP浓度及PKA、成熟作用促进因子 (MPF)活性变化。并应用cAMP及蛋白激酶抑制剂 (PKI)显微注射入 1 细胞期受精卵内 ,观察卵细胞形态学变化及卵裂率、死亡率。结果 :小鼠受精卵1 细胞期 ,伴随MPF活性变化 ,M期cAMP浓度下降 ,M中期最低 ,M末期升高 ,与PKA趋势一致。cAMP显微注射后卵细胞胞膜及透明带变形 ,形态不规则 ,无卵裂发生 ;PKI显微注射后核不规则分裂增加 ,正常卵裂率下降。两者死亡率均高于对照组。结论 :cAMP注射升高PKA活性可使卵细胞发育迟缓 ,PKI注射抑制PKA活性引起核不规则分裂。

CDC25B蛋白S149/S321位点突变对小鼠1-细胞期受精卵发育的影响

目的:研究小鼠CDC25B蛋白S149位点对小鼠1-细胞期受精卵发育的影响及S149位点与S321位点的关系。方法:构建pBSK-CDC25B-S149A和pBSK-CDC25B-S149A/S321A突变体,体外转录成mRNA;采用小鼠超排卵技术取G1期受精卵,显微注射CDC25B-WT-mRNA和突变CDC25B-S149A-mRNA、CDC25B-S149A/S321A-mRNA,观察其对受精卵发育、M期促进因子(MPF)活性及CDC2-pTyr15磷酸化状态的影响。结果:CDC25B-S149A-mRNA注射组受精卵卵裂率明显高于CDC25B-WT-mRNA注射组,MPF活性提前1 h达到高峰;而联合突变体CDC25B-S149A/S321A-mRNA注射组卵裂率又显著高于CDC25B-S149A-mRNA注射组。结论:在小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂过程中,蛋白激酶A(PKA)对小鼠CDC25B蛋白S149位点的磷酸化修饰是控制受精卵G2/M转换的重要方式,并且S149位点与S321位点可能具有协同作用。

深Ⅱ度烫伤大鼠创缘皮肤组织中表皮细胞增殖的研究

目的 观察大鼠深Ⅱ度烫伤后创缘皮肤组织中表皮细胞的增殖活动规律,探讨其可能机制。 方法 将24只SD大鼠随机分为正常组(未烫伤)、烫伤后3d组、7d组及14d组,每组6只。采集正常组大鼠皮肤及烫伤大鼠创缘皮肤,观察其表皮组织学特征;用流式细胞仪检测表皮细胞的细胞周期;蛋白印迹法检测表皮细胞增殖调节因子细胞周期素(cyclinD1、cyclinB1)和细胞周期素依赖性激酶(CDK)4的表达水平,并测定M期促进因子(MPF)的组蛋白激酶活性。 结果 组织学观察显示,伤后3d组大鼠创缘表皮细胞核及核仁较正常组增大;伤后14d组胞核及核仁增大明显,细胞数显著增多。伤后14d组S期表皮细胞百分比出现上升趋势;G2 /M期百分比自伤后3d起逐渐升高,伤后7、14d组(4. 5±0. 6、5. 4±1. 0)显著高于正常组(2. 9±1. 1,P<0. 05).cyclinD1表达量伤后3d即明显增高;cyclinB1表达无显著波动。伤后3d组的CDK4表达水平较低, 14d组开始回升。伤后14d组表皮细胞MPF活性显著增强。 结论 在细胞周期调控因子作用下,大鼠深Ⅱ度烫伤后皮肤组织中表皮细胞在伤后早期即出现DNA合成及有丝分裂的增加,伤后14d增殖明显活跃。cyclinD1 /CDK4复合物的表达及MPF的活性在伤后早期并未同步增高,但自伤后14d起其表达显著增多,提示创面愈合过程中细胞周期调?