TGF-β_2干预的缺氧状态下补肾活血剂对Mller细胞及谷氨酰胺合成酶活性的影响

目的观察在缺氧和(或)转化生长因子-β2(TGF-β2)干预条件对体外培养的Mller细胞活力以及谷氨酰胺合成酶(GS)的影响。方法用出生7d的SD大鼠体外培养视网膜Mller细胞,将第2代细胞在含20%胎牛血清的DMEM中培养24h后,换用无血清的DMEM孵育24h。分组为:空白血清对照组(20%正常SD大鼠血清的DMEM);TGF-β2组(20%正常SD大鼠血清的DMEM及终质量浓度为150ng/L的TGF-β2);模拟缺氧组(20%正常SD大鼠血清的DMEM及终浓度1.0mmol/L的连二亚硫酸钠);TGF-β2+缺氧组(20%正常SD大鼠血清的DMEM液、终浓度1.0mmol/L的连二亚硫酸钠和终质量浓度为150ng/L的TGF-β2);中药血清组(20%中药SD大鼠血清的DMEM);中药血清+TGF-β2+缺氧组(20%中药SD大鼠血清的DMEM、终浓度1.0mmol/L的连二亚硫酸钠和终质量浓度为150ng/L的TGF-β2)。以透射电镜观察视网膜Mller细胞超微结构、以490型酶标仪测定细胞外液乳酸脱氢酶(LDH)释放量及GS活性。结果在缺氧条件下Mller细胞的超微结构发生明显的改变,如:细胞核变形,固缩;细胞器破坏;微绒毛内糖原明显增多。与正常对照组比较,TGF-β2干预组、缺氧组、TGF-β2+缺氧组的LDH释放量均明显增加(P<0.05),缺氧组、TGF-β2+缺氧组的GS活性均明显下降(P<0.01);与缺氧组比较,TGF-β2+缺氧组的LDH释放量明显增加、GS活性明显下降(P<0.05、P<0.01)。补肾活血中药血清能降低24h及48h时正常以及TGF-β2与缺氧同时存在条件下LDH的释放量(P<0.05),增强12h时正常条件下以及12h和24h时TGF-β2与缺氧同时存在条件下GS的活性(P<0.05、P<0.01)。结论 TGF-β2可加重缺氧条件下Mller细胞活力与GS活性的降低;补肾活血中药含药血清能增强视网膜Mller细胞活力及GS活性。

缺氧条件下高糖及高胰岛素对Mller细胞VEGF表达的影响

目的观察缺氧、高糖及高胰岛素对视网膜Mller细胞胞浆内血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法采用组织块悬浮贴壁法原代培养兔视网膜Mller细胞,于正常和缺氧条件下分别分为对照组、高糖组、高浓度胰岛素组、高糖高浓度胰岛素组,通过AO/EB染色法观察不同缺氧时相Mller细胞的凋亡情况,免疫细胞化学染色测定各组Mller细胞胞浆内VEGF的表达。结果免疫细胞化学技术测定结果显示缺氧条件下1、2、3d各实验组与对照组相比VEGF表达量增加差异均有统计学意义(P<0.05)。缺氧2d、3d各实验组与正常条件下各实验组相比VEGF表达增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论缺氧条件下高糖及高胰岛素环境刺激Mller细胞VEGF表达作用增强。

蛋白激酶C活性调节剂对豚鼠近视眼视网膜Mller细胞的作用及意义

目的研究蛋白激酶C(PKC)激活剂PMA和抑制剂GF109203X对豚鼠近视眼视网膜Mller细胞生长状态及PKC蛋白表达的影响。方法眼罩遮盖诱导近视模型,酶消化法培养其视网膜Mller细胞,并鉴定。PMA、GF109203X分别干预近视眼Mller细胞。MTT测细胞活力,TUNEL染色检测凋亡细胞,Westrenblotting测PKC蛋白表达。结果95%以上的培养细胞阳性表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和波形蛋白(Vimentin)。近视组PKC蛋白表达较正常组上调(P<0.05)。PMA、GF109203X均能引起近视眼Mller细胞的抑制率升高和诱导其凋亡(P<0.05)。PMA诱导近视眼Mller细胞PKC蛋白表达进一步上调,100nmol/L组和1000nmol/L组表达量高于10nmol/L组(P<0.05)。1μmol/L和10μmol/LGF109203X均能引起近视眼Mller细胞PKC蛋白表达下调,10μmol/L的抑制作用大于1μmol/L(P<0.05)。结论PKC蛋白在豚鼠近视眼视网膜Mller细胞表达升高,且其表达受PMA和GF109203X调控。

PKC对豚鼠近视眼视网膜Mller细胞近视因子基因的调控作用

目的研究蛋白激酶C(PKC)对豚鼠近视眼视网膜Mller细胞中酪氨酸羟化酶(TH)、诱导型NO合成酶(iNOS)、神经型NO合成酶(nNOS)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β(TGFβ)基因表达的调控作用。方法眼罩遮盖法建立豚鼠近视眼模型,酶消化法原代培养其视网膜Mller细胞,GFAP免疫组织化学染色进行细胞鉴定。根据干预因素不同,把Mller细胞分为正常对照组、近视组、近视+GF109203X组、近视+PMA组和近视+DMSO组。RT-PCR检测TH、iNOS、nNOS、bFGF和TGFβmRNA的表达情况。结果与正常对照组比较,近视眼视网膜Mller细胞iNOS、nNOS、bFGF和TGFβ mRNA表达上调,TH mRNA表达下调(P<0.05)。PKC激活剂(PMA)激活PKC后,近视眼视网膜Mller细胞表达nNOS、iNOS、TH和bFGF mRNA上调(P<0.05);GF109203X抑制PKC活性后,这些因子的mRNA表达下调(P<0.05)。结论豚鼠近视眼视网膜Mller细胞nNOS、iNOS、bFGF和TH基因的表达受PKC调控,Mller细胞可能为近视信号因子的一个重要来源。

牛磺酸对高糖刺激Mller细胞VEGF和TauT表达的影响

目的通过检测高糖和牛磺酸培养对大鼠视网膜Mller细胞中血管内皮细胞生长因子(vascular en-dothelial growth factor,VEGF)和牛磺酸转运蛋白(taurine transporter,TauT)表达的影响,探讨牛磺酸保护糖尿病引起视网膜损伤的机制。方法实验分6组,分别是正常对照组、牛磺酸对照组、高糖模型组、低、中、高剂量牛磺酸处理高糖组。用免疫细胞荧光双标鉴定Mller细胞,RT-PCR和免疫细胞荧光双标检测Mller细胞中VEGF和TauT的表达。结果体外25mmol/L高糖培养使Mller细胞VEGF mRNA及蛋白表达增加。10mmol/L牛磺酸可有效抑制高糖诱导的VEGF上调表达(P<0.05);高糖诱导Mller细胞中TauT表达抑制,引起TauTmR-NA及蛋白表达明显下降。牛磺酸干预可上调Mller细胞中TauT的表达(P<0.05),提高细胞内外牛磺酸的转运能力。结论体外高糖培养诱导Mller细胞VEGF表达增加,TauT表达下降。牛磺酸通过降低VEGF表达、提高牛磺酸转运能力达到保护视网膜的作用。该实验结果可为牛磺酸用于糖尿病早期视网膜病变的防治提供重要的实验依据。

脂质体法和电穿孔法体外转染SD大鼠视网膜Mller细胞的比较

目的:探讨脂质体法及电穿孔法介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养的视网膜Mller细胞的可行性和区别。方法:体外培养出生后7～10d的SD大鼠视网膜Mller细胞,免疫荧光染色法鉴定95%以上为视网膜Mller细胞。分别用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导的脂质体转染法和电穿孔法将质粒PEGFP-N1转染视网膜Mller细胞,荧光显微镜下检测转染后1,2,3,4d的转染效率,并持续观察至转染后14d,比较两者基因表达持续时间。结果:荧光显微镜下检测转染后1d,两组均可见少量细胞表达EGFP绿色荧光蛋白。转染后2d,两者转染效率均达到最大,并且电穿孔法介导质粒PEGFP-N1转染Mller细胞效率约为31.0%±2.8%,较脂质体法转染效率(10.5%±2.4%)更高。两者比较有统计学意义(P<0.01)。随后,两者转染效率均逐渐降低。电穿孔转染后的PEGFP-N1可在视网膜Mller细胞内持续表达近14d,而脂质体转染后仅能表达约7d。结论:脂质体法和电穿孔法均适用于视网膜Mller细胞的基因转染,但电穿孔法效率更高,表达时间更长。

bFGF对兔眼视网膜挫伤Mller细胞Vimentin表达的影响

目的研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对兔视网膜挫伤后Mller细胞的影响。方法26只白兔通过3J能量自由落体的方式制作兔眼挫伤性视网膜病变模型,随机分为bFGF实验组、生理盐水对照组、单纯挫伤组、正常对照组。其中正常对照组2只(4只眼),单纯挫伤组4只(8只眼),bFGF实验组和生理盐水对照组各10只(20只眼)。bFGF实验组每2d玻璃体腔内注射bFGF2μg(10μL),生理盐水对照组注射生理盐水10μL。采用免疫组织化学染色检测视网膜挫伤后3h,1、3、7、14d各时间点Mller细胞波形蛋白(Vimentin)的表达。结果bFGF实验组视网膜Mller细胞Vimentin的表达高于生理盐水对照组,且呈上升趋势,两组比较各时段差异均有统计学意义(P<0.05)。结论bFGF可以增强视网膜Mller细胞Vimentin的阳性表达,加速Mller细胞的活化,促进损伤修复。

谷氨酸对视网膜Mller细胞超微结构和谷氨酰胺合成酶表达的影响

目的探讨谷氨酸对大鼠视网膜Mller细胞超微结构和谷氨酰胺合成酶(GS)表达的影响。方法取5～7d清洁级Wistar乳鼠视网膜,在含质量分数10%新生牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中传代培养大鼠视网膜Mller细胞。第3代Mller细胞培养基中加入终浓度分别为10、20、50、100、200μmol/L的谷氨酸作用10min。正常对照组Mller细胞培养基中未加入谷氨酸。通过免疫细胞化学法检测GS的表达鉴定视网膜Mller细胞。透射电镜观察各组Mller细胞超微结构的改变。采用Westernblot法半定量检测GS的表达。结果培养的Mller细胞中,GS阳性细胞达95%以上。透射电镜下正常对照组Mller细胞超微结构正常,谷氨酸10、20、50μmol/L组Mller细胞超微结构无明显改变。100μmol/L谷氨酸组可见Mller细胞线粒体肿胀和染色质的凝集、边聚。在200μmol/L谷氨酸组可见Mller细胞空泡样变性和凋亡小体。Westernblot结果显示,10、20、50μmol/L组GS在Mller细胞中表达较正常对照组升高,差异均有统计学意义(q=29.32、q=75.54、q=48.36、q=130.20,P<0.01),50μmol/L谷氨酸组GS的表达达高峰,100μmol/L谷氨酸组表达开始下降,200μmol/L谷氨酸组的表达低于正常对照组(q=46.67,P<0.01)。结论谷氨酸浓度影响视网膜Mller细胞中GS的表达,谷氨酸浓度超过50μmol/L可引起视网膜Mller细胞超微结构的改变。

Mller细胞对青光眼视网膜神经节细胞影响的研究进展

视网膜神经节细胞(RGCs)的过度凋亡是青光眼病理改变的基础。Mller细胞作为视网膜的主要神经胶质细胞,对于维持神经元的完整性、代谢、内环境稳态以及信号转导等均具有重要的作用。随着对Mller细胞研究的逐渐深入,发现Mller细胞不仅参与了青光眼性RGCs的凋亡机制,而且还参与了RGCs的代偿性保护机制。那么Mller细胞是如何对RGCs起作用,它又是通过什么机制参与青光眼引起的RGCs凋亡以及代偿性保护作用呢?就这些问题的最新研究进展进行综述。

大鼠视网膜Mller细胞受刺激后具有神经干细胞的特性

目的:研究并验证成年哺乳动物视网膜中Mller细胞经刺激后可以产生神经干细胞特性。方法:对6周龄VC大鼠右眼玻璃体腔内注射神经毒素混合液(含NMDA,kainate,FGF2和insulin)刺激Mller细胞,左眼玻璃体内注射PBS作为对照眼。1wk后取眼并分离Mller细胞体外原代纯化培养7d。流式细胞技术鉴定Mller细胞纯度,通过细胞免疫荧光组织化学和流式细胞技术鉴定神经干细胞标志物nestin在Mller细胞上的表达。结果:流式细胞分析结果显示,本实验分离培养的原代Mller细胞纯度可达96%以上;细胞免疫荧光组织化学显示激活后Mller细胞能表达nestin,流式细胞技术证明,激活后培养的细胞中表达nestin的细胞可达总细胞量的53.5%。结论:成年大鼠视网膜Mller细胞经神经毒素在体刺激后可以产生神经干细胞特性。

正常大鼠视网膜Mller细胞的形态学分布特征

目的:观察正常大鼠Mller细胞在视网膜不同层面的形态分布特征。方法:应用光镜和透射电镜观察正常大鼠视网膜Mller细胞的形态结构分布特征。结果:Mller细胞不均匀分布于视网膜的各个层面,在内网状层、神经节细胞层和神经纤维层分布最多。结论:Mller细胞不仅是视网膜的支架,而且在视网膜神经节细胞层与神经纤维层代谢活跃,是重要的神经胶质细胞。

糖基化终产物对视网膜Müller细胞表达血管内皮生长因子的影响

目的探讨糖基化终产物(AGEs)对体外培养兔视网膜Mller细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法用牛血清白蛋白AGEs(AGEs-BSA)及其对照物作用兔视网膜Mller细胞,免疫细胞化学法半定量检测Mller细胞内VEGF的表达水平。结果与对照组相比,AGEs可明显增加Mller细胞VEGF的表达,且具有一定的时间及浓度依赖性。结论诱导Mller细胞VEGF的表达,可能是AGEs促进糖尿病视网膜病变进展的可能机制之一。

花色苷对高糖、高胰岛素下Müller细胞合成VEGF的影响

目的观察高糖、高胰岛素培养下Mller细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的合成与分泌,以及花色苷对其合成、分泌VEGF的影响。方法对大鼠视网膜Mller细胞进行原代培养。用50mmol.L-1葡萄糖和不同浓度的胰岛素处理Mller细胞24h,分为高胰岛素组(3kU.L-1胰岛素)、低胰岛素组(3U.L-1胰岛素)和对照组(不含胰岛素)。分别用121.1μmol.L-1、22.8μmol.L-1、0μmol.L-1花色苷对各组细胞进行干预。48h后用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定上清液中VEGF的含量,免疫细胞化学测定Mller细胞中VEGF的表达。结果相比对照组,高胰岛素处理Mller细胞后上清液与细胞中的VEGF表达均增加;低浓度和高浓度花色苷均可使该组细胞与上清液中的VEGF表达减少,与未加入花色苷的Mller细胞相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。经2种浓度花色苷分别处理后,高胰岛素组与对照组上清液和细胞中的VEGF表达差异均无统计学意义(均为P>0.05),2种浓度之间差异亦无统计学意义(均为P>0.05)。结论高浓度胰岛素在短期内即可使Mller细胞合成、分泌VEGF增加,花色苷能有效逆转该过程。

高糖对视网膜Müller细胞VEGF,EPO和EPOR mRNA表达的影响

目的:观察高糖条件下VEGF mRNA,EPO mRNA和EPORmRNA在体外培养的Mller细胞中的表达情况。方法:胰蛋白酶将新生小鼠视网膜组织吹打消化后,制成单细胞悬液,体外培养Mller细胞,RT-PCR测定高糖条件下视网膜Mller细胞VEGF,EPO和EPOR基因的表达。结果:成功获得视网膜Mller细胞,传代后90%以上的细胞呈兔抗鼠谷氨酰胺合酶(GS)染色阳性。Mller细胞VEGF mRNA,EPO mRNA和EPOR mRNA在高糖条件下表达升高,且呈浓度依赖性(P<0.05),但糖浓度50mmol/L组较40mmol/L组差异无统计学意义,无明显时间依赖性。结论:Mller细胞在高糖条件下VEGF,EPO,EPOR的表达增加。

巢蛋白——一种新的视网膜损伤生物标记物

目的探讨Mller细胞在视网膜损伤中的作用,探讨巢蛋白(nestin)是否是一个更有价值的评价视网膜损伤的生物标记物。方法33只健康成年SD大鼠,其中3只做为正常对照,于各模型制作之前取材;6只制作大鼠视网膜缺氧模型,先于体积分数9%氧浓度箱中2h,其中3只在体积分数80%氧浓度中治疗2h后,均置于正常环境24h后取材;15只右眼制作青光眼模型,左眼作假手术对照,分别于术后2h、1d、3d、1周、3周取材(每个时间点3只);9只右眼制作视神经横断模型,分别于术后1d、3d、1周取材;作眼球矢状位冰冻切片,行nestin及谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)或胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)及GS免疫荧光双标记,共聚焦显微镜读片分析。结果健康成年SD大鼠视网膜Mller细胞不表达nestin和GFAP,视网膜损伤后(缺氧、青光眼、视神经横断),Mller细胞均出现nestin的诱导表达,青光眼模型中nes-tin在Mller细胞上的诱导表达随病程延长持续升高;视神经横断后1dMller细胞即出现nestin的诱导表达,3d时其表达进一步增强,1周时表达轻度减弱;在视网膜缺氧模型中Mller细胞有明显nestin的诱导表达,而给予高氧治疗后其表达明显减弱。青光眼和视神经横断后Mller细胞上出现GFAP的诱导表达,但在缺氧模型中未发现GFAP表达。结论nestin是一种新的、有价值的视网膜损伤生物标记物。视网膜损伤后nestin、GFAP、GS在Mller细胞足板处的聚集对维持视网膜结构完整性和促进功能恢复可能具有重要的意义。

DL-α-AAA诱发恒河猴特发性黄斑旁毛细血管扩张症

目的:选择性干扰黄斑区Mller细胞,试图建立特发性黄斑旁毛细血管扩张症(idiopathic perifoveal telangiectasis,IPT)动物模型。方法:恒河猴12只随机分为6组,前3组单眼视网膜下注入DL-α-AAA(DL-α-aminoadipic acid)5,10,50mmol/L30μL,后3组单眼玻璃体腔分别注入DL-α-AAA16,50,80mmol/L100μL。术前1wk及术后6,12wk行眼底彩色照相、荧光素眼底血管造影、黄斑自发荧光、光学相干断层成像(optical coherence tomography,OCT)、多焦视网膜电图(multifocal electroretinogram,mfERG)检测,并摘除眼球行光镜检查。结果:视网膜下5,10mmol/LDL-α-AAA及玻璃体腔50mmol/LDL-α-AAA,给药后6wk均出现IPT且OCT和光镜亦有相应病理改变;视网膜下50mmol/LDL-α-AAA,及玻璃体腔80mmol/LDL-α-AAA,病理损伤严重但未出现IPT。结论:视网膜下5～10mmol/LDL-α-AAA、玻璃体腔50mmol/LDL-α-AAA均可诱发IPT。