动物RNA病毒检测关键试剂—反转录酶(M-MLV RTase)的制备

反转录酶是动物RNA病毒分子诊断用到的关键试剂之一。为获得纯度高、活性高、制备简单经济的M-MLV RTase,本试验将M-MLV RTase的基因序列进行密码子优化,合成并构建表达载体。将表达载体转化到大肠杆菌E.coli Rosetta宿主菌种,经IPTG诱导后实现M-MLV RTase的可溶性表达。利用Ni2+柱亲和层析纯化载有6x His标记的重组MMLV RTase,对重组酶进行Western Blotting试验,鉴定为M-MLV RTase。通过对动物流感病毒RNA的普通RT-PCR和荧光RT-PCR检测来评价重组酶的活性并估测其活性单位。将活性单位相当的重组酶和商品酶进行比较,结果显示,制备的重组酶活性高,对不同浓度病毒RNA的检测结果与商品酶相当。研制的M-MLV RTase可以用于动物RNA病毒的分子诊断。

富勒烯(C_(60))对RNA逆转录的影响

目的:研究富勒烯(C60)对RNA逆转录(Reverse Transcription,RT)反应的影响。方法:以斑马鱼鱼肝mRNA为模板,在M-MLV逆转录酶作用下合成cDNA,并在RT反应体系中添加不同浓度的C60,分别研究C60对M-MLV逆转录酶和RNA构象的影响。结果:100μg/mL C60可显著抑制RT反应,抑制效应与C60浓度相关,但增加M-MLV逆转录酶量可以有效逆转C60对RT的抑制作用。C60与RNA在37℃避光孵育12 h后,C60可特异降解28S rRNA,同样具有浓度依赖性。结论:C60不仅可显著抑制M-MLV逆转录酶活性,而且对RNA也具有一定的损伤作用,C60具有潜在的基因毒性。