牛呼吸道合胞体病毒一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)快速简便的检测方法,本研究基于BRSV M基因保守区序列,设计特异性引物及探针,通过优化反应条件,建立用于BRSV检测的一步法实时荧光定量PCR,并验证了该方法的敏感性、特异性和重复性;同时利用建立的检测方法对采集的临床样本进行检测。结果表明:本研究所建立的BRSV荧光定量检测方法,其特异性好,仅对BRSV存在特异性扩增;敏感性高,最低可达10 copies/μL;稳定性好,组内变异系数和组间变异系数小。使用所建立的BRSV一步法实时荧光定量PCR对宁夏地区94份临床样品进行检测,阳性率为5.3%(5/94)。上述结果表明,本研究建立的检测方法可为BRSV的快速诊断提供有力的技术支持。

猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、灵敏的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)早期痕量检测方法,该研究以PEDV的M基因为靶基因,设计了特异性引物和锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)-TaqMan探针,经过条件优化,建立了基于LNA-TaqMan探针的PEDV荧光定量PCR方法,并与常规TaqMan探针法进行了比对。结果显示,所建立的PEDV的LNA-Taq-Man探针荧光定量PCR方法最低检测限为3.2拷贝/微升,较常规TaqMan探针法提高了10倍;与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒等多种病原不存在交叉反应,特异性良好;批内和批间重复性结果的变异系数均小于1%,重复性较好。应用该方法对103份临床样品进行检测,结果显示,共检出PEDV阳性样品47份,阳性率45.63%,与常规TaqMan探针法检测结果的阳性符合率为90.38%。本研究建立的基于LNA-TaqMan探针的荧光定量PCR方法为PEDV的精准检测和流行病学调查提供了一种新的技术选择。

猪δ冠状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

建立一种快速检测猪δ冠状病毒(PDCoV)的方法。根据GeneBank收录的PDCoV M基因序列,设计两对特异性引物和TaqMan探针,对PDCoV TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件进行优化。Ct值与质粒模板之间呈现良好的线性关系,标准方程为y=-3.6421x+34.194,相关系数R 2=0.9992。荧光定量RT-PCR方法仅对PDCoV呈现特异性扩增,无交叉反应。敏感度试验结果显示,最低检出量为1.25×10^(1)copies/μL,灵敏度高。重复性试验结果显示,批内和批间测定均具有良好的重复性。TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法是一种可靠的快速检测PDCoV的方法。

101例乙肝患者HBV DNA前C区 nt 1896位点基因突变的研究

用错配聚合酶链反应（Ｍ－ＰＣＲ）及限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析方法对１０１例乙肝病毒感染者 ＨＢＶ ＤＮＡ前 Ｃ区 ｎｔ １８９６（Ｇ→Ａ）点突变进行检测。结果共检出 １８９６（Ｇ→Ａ）点突变株感染者２９例，检出率２６．１３％。其在慢性肝炎患者及肝硬化患者中的检出率明显高于急性肝炎患者中，（Ｐ＜０．０５），在肝硬化及慢性重症肝炎患者中的检出率又高于在慢性肝炎患者中（Ｐ＜０．０１）。同时对慢性肝炎患者中检出突变的病例和未检出突变的病例进行了 ＡＬＴＡＳＴ以及ＴＢＩＬ的比较，结果差别有显著性（ Ｐ＜０．０５）。以上结果说明，ＨＢＶ前 Ｃ区 ｎｔ １８９６位（Ｇ→Ａ）变异株感染可能是导致部分病人病情加重的原因之一，与肝脏病变的活动有关。

国内部分地区多杀性巴氏杆菌荚膜血清型和基因型的研究

为了解国内部分地区不同动物多杀性巴氏杆菌(P.multicida)流行情况,本研究以36株P.multicida为研究对象,通过多重荚膜PCR、多位点序列分型(MLST)和脂多糖多重PCR(LPS-m PCR)对其荚膜型和基因型进行鉴定。采用多重荚膜PCR方法将36株细菌的荚膜血清型分为A、B和D 3种,其中禽源P.multicida主要以A为主;以LPS-m PCR方法将P.multicida分为L1、L2、L3和L6 4种LPS基因型,禽源P.multicida主要为L1型;通过MLST技术将P.multicida分为ST-129、ST-8、ST-58、ST-5、ST-13、ST-50和ST-122 7种ST型,禽源P.multicida主要为ST-129型。本研究为P.multicida的流行病学监测和基因多样性提供了技术支撑。

Mitf-M在羊驼皮肤组织的表达与序列分析及免疫组织化学定位

【目的】克隆羊驼皮肤组织表达的Mitf-M CDS序列,比较分析羊驼皮肤组织Mitf-M的特征,进一步定位分析Mitf-M蛋白表达的位置,为深入研究羊驼毛色基因表达机制奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增方法分段扩增Mitf-M CDS区,分别利用Clustal X和BioEdit生物学软件对氨基酸序列进行多重序列比较分析,免疫组织化学技术对Mitf-M蛋白定位分析。【结果】羊驼皮肤组织表达的Mitf-M的CDS区由419个氨基酸组成,具有bHLH-zip转录家族的保守结构域,该基因与牛和犬亲缘关系最近,Mitf-M蛋白主要分布于羊驼皮肤组织毛球基底层细胞之间与毛乳头周围的黑色素细胞中。【结论】与其它物种相比较,羊驼皮肤组织表达的Mitf-M蛋白保守性很强,在进化过程中的变异不大,可见Mitf-M为毛发的色素沉积提供重要的物质基础。

马铃薯种苗复合感染病毒多重RT-PCR同步快速检测

基于马铃薯病毒ssRNA的快速制备方法,根据马铃薯病毒CP基因序列设计PVX、PVS、PVY和PLRV特异性引物对、P1基因序列设计PVA特异性引物对,建立了多重RT-PCR快速检测体系,可以同步检出复合侵染马铃薯种苗主要病毒,灵敏度比传统的ELISA至少高100倍.结合生物活性稳定剂研制的固相化检测试剂盒,已用于四川和重庆等省区的15个县市田间与苗圃248个马铃薯显症或无症样品的实际检测,表明四川和重庆地区2～3种马铃薯病毒往往复合侵染(PVX、PVA和PVS三种病毒复合侵染或PLRV和PVY二种病毒复合侵染).

多重RT-PCR一步法技术同时检测猪瘟病毒和蓝耳病病毒方法的建立以及初步应用

猪瘟病毒和蓝耳病病毒均能导致猪繁殖障碍,对养猪生产影响很大。根据猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病(PRRS)的基因保守序列设计了2对针对这2种病毒的特异引物,并建立了多重RT-PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明能同时扩增得到2条与试验设计相符的167bp(CSFV)和320bp(PRRS)特异性条带,同时具有较好的特异性;敏感性检测结果表明,临床阳性的样品提取的核酸稀释1000倍后仍能检测出CSFV和PRRSV。本方法的建立对于这2种病毒病的早期快速检测具有十分重要的意义。

牛乳源金黄色葡萄球菌耐药性变迁及β内酰胺类药物耐药基因分析

采用肉汤微量稀释法,对203 株源于2006—2011年四川牛乳源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,Sa)进行10 种常用抗生素药敏性检测,多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,M-PCR)法对其耐甲氧西林基因(mecA)和β-内酰胺类药物耐药基因(blaZ)进行分析,了解Sa耐药性变迁。结果表明:牛乳源Sa菌株对青霉素、氨苄西林耐药率一直居高不下;对阿莫西林/克拉维酸、红霉素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑耐药率有增强趋势;对林可霉素、四环素耐药率呈降低趋势;对环丙沙星耐药率不定;对苯唑西林和头孢噻呋敏感;Sa分离株多重耐药率介于72.1%～100.0%,显示出不尽相同的耐药谱,却呈现出不断增宽的趋势。M-PCR检测显示,2006—2011年分离Sa菌株未从基因水平扩增出mecA基因;不同年度分离株均不同程度携带blaZ基因,不同年度分离株blaZ+检出率介于49.1%～87.5%。药敏实验结果与相关耐药基因检测结果存在对应关系,部分菌株的耐药性与耐药基因的检出率不一致,推测还存在其他耐药机制。结论:四川地区牛乳源金黄色葡萄球菌耐药性不容乐观。

分枝杆菌在北京水源环境中的分布：M.arupense国内首次报告

目的:研究北京水源中分枝杆菌的分布,应用表型鉴定方法和分子生物学方法进行分枝杆菌鉴定,并比较两种方法的准确性和优缺点。方法:采集水源环境标本,进行分枝杆菌分离培养,通过生化反应对所有分离株进行鉴定,同时从培养菌落中提取分枝杆菌DNA,用PCR扩增65ku热休克蛋白基因,扩增产物分别应用两种限制性内切酶BstEⅡ和HaeⅢ酶切,进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析和PCR产物的测序分析。结果:从30份养鱼水中分离出35株分枝杆菌。①表型鉴定结果:RunyonⅠ群1株,可疑为海分枝杆菌;RunyonⅡ群7株,确定为戈登分枝杆菌或疑似戈登分枝杆菌;RunyonⅢ群9株,未鉴定到种;RunyonⅣ群18株,其中龟-偶发分枝杆菌复合群9株,其余9株未鉴定到种。②PCR-RFLP鉴定结果:戈登分枝杆菌8株,龟-偶发分枝杆菌复合群8株(包括M.peregrinum1株),疑似日内瓦分枝杆菌10株,其余9株未鉴定到种。③PCR产物测序鉴定:戈登分枝杆菌10株,M.arupense9株,偶发分枝杆菌7株,土分枝杆菌6株,不产色分枝杆菌1株,M.peregrinum1株,脓肿分枝杆菌1株。结论:非结核分枝杆菌(NTM)广泛存在于养鱼水中,分枝杆菌采用65ku热休克蛋白基因PCR扩增配合测序鉴定较传统表型鉴定和PCR-RFLP更准确。

耐多药肺结核耐药基因突变与临床疗效探讨

目的了解耐多药肺结核耐药基因的突变与临床疗效的关系,为耐多药肺结核的治疗提供参考依据.方法 108例病人痰标本用PCR-SSCP方法检测了五种耐药基因和传统的药敏试验,并与临床疗效进行比较分析.结果耐多药肺结核耐药基因检测率分别是耐异烟肼的katG基因突变率为70.4%,耐利福平的rpoB基因突变率72.2%,耐链霉素的rpsL基因突变率71.9%,耐吡嗪酰胺的pncA基因突变率53.4%,耐乙胺丁醇的embB基因突变率31.7%,其中高浓度耐药菌的基因突变率远高于低浓度的突变率.根据药敏试验及耐药基因检测结果指导治疗,应用以KAOP为基础的化疗方案,配合患者过去未曾用过的1～2种抗结核药物,经过平均1.4年的治疗,108例耐多药病人74.1%的病人痰菌阴转,且67.5%的病人痰结核杆菌培养阴转,83.3%的病人病灶吸收好转,65.3%的空洞闭合,取得了临床上较为满意的疗效.结论对耐多药肺结核进行耐药基因检测是一项重要工作,对指导治疗及预后判断有一定的参考价值.但尚需进行更多的观察.

低温肉制品中3种食源性致病菌多重聚合酶链式反应快速检测方法的建立

针对低温肉制品中较易污染的沙门氏菌(Salmonella spp.)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等有害微生物,利用多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,m-PCR)的方法,对3种菌同时快速检测,从而达到节省时间,提高效率的目的。使用沙门氏菌的inv A基因、金黄色葡萄球菌的Prf A基因和单增李斯特菌nuc基因设计3对特异性引物,在确定特异性引物的基础上,将3种菌进行培养增菌后接种于低温肉制品中,过夜富集后收集并进行灵敏度检测,优化多重PCR反应体系并应用于实际样品的检测。结果表明:多重PCR方法在同时检测这3种有害微生物时,m-PCR最佳反应条件如下:25 μL反应体系、10×PCR缓冲液2.5 μL、2.5 mmol/L d NTPs 2.0 μL、2.5 U/μL的DNA聚合酶0.5 μL及上、下游引物各0.5 μL、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的模板1.0 μL、沙门氏菌的模板2.0 μL,加dd H_2O补足至25 μL,最佳退火温度为64℃。多重PCR快速检测方法适用于低温肉制品中沙门氏菌等3种食源性致病菌的检测,具有快速、灵敏、特异、简便等特点。

食品中3种致病菌多重PCR检测体系的建立及初步应用

目的:建立同步速测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法:利用基因组比对法寻找3种致病菌的特异性序列——沙门氏菌的invA基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因和单增李斯特菌的prs基因,运用Primer Premier 5.0分别设计3对片段大小不同的特异性引物;通过优化反应体系,建立3种致病菌的多重PCR检测体系。结果:建立的多重PCR方法灵敏度测试结果分别为7.6、3.8、5.1pg/μL,在此灵敏度下可以扩增出全部特异性引物条带,验证性实验结果出现相应的目的条带且未发生交叉影响。结论:初步建立能同步、简便、快速、灵敏地检测食品中沙门菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌的三重PCR方法。

蚌埠地区产超广谱β-内酰胺酶菌株CTX-M型耐药基因的分布

目的了解蚌埠市部分医院临床分离产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中CTX-M型ESBLs基因分布情况。方法标本为蚌埠市3所医院2003年4月-2004年4月间,临床分离产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌147株;采用聚合酶链反应(PCR)扩增产CTX-M型ESBLs菌株基因;按Sanger双脱氧末端终止法,用自动测序仪对其进行测序以鉴定基因型。结果147株产ESBLs菌株中有92株携带CTX-M型ESBLs基因,其中CTX-M-14型52株、CTX-M-3型20株、CTX-M-15型20株。结论蚌埠市部分医院产CTX-M型ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌检出率较高,主要为CTX-M-14型。

乙型肝炎病毒DNA定量分析的临床意义

目的:探讨乙型肝炎病毒HBV DNA含量与血清标记物的相关性及其对乙型肝炎诊断、预后的意义。方法:采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测1652例乙肝患者血清学标记物(HBV—M),其血清学模型包括以下9种组合;并选取160例HBV M全阴性正常人作为对照。实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测血清中HBV DNA含量。结果:1、2组HBV DNA阳性率为98.4%和96.67%,明显高于其它组。结论:HBV DNA含量与乙肝病毒e抗原具有显著相关性,HBV M和HBV DNA定量检测对于临床乙肝病毒感染、复制及临床治疗有重要意义。

应用RT-nested PCR检测猪传染性胃肠炎病毒

根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,利用Primer5.0程序软件,设计并合成了M基因的2对引物,以mRNA为模板,通过RT-PCR,RT-nestedPCR方法,成功扩增出长度为1328bp和1037bp的TGEV目的片段,但未扩增出猪传染性腹泻病毒(PEDV)片段。在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了快速检测TGEV的诊断方法。结果表明,RT-nestedPCR方法可用于检测猪传染性胃肠炎病毒,而且此方法简单省时、灵敏性高,可以作为检测RNA病毒的一种分子生物学方法。

用PCR-限制性片段长度多态性分析法检测游泳池肉芽肿中海分枝杆菌

目的:探讨用PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)分析法快速检测游泳池肉芽肿组织中海分枝杆菌。方法:对疑诊为游泳池肉芽肿患者5份皮损组织DNA进行PCR扩增,扩增产物分别用BstEⅡ和HaeⅢ两种限制性内切酶进行酶切,再用琼脂糖凝胶电泳进行RFLP分析,并与培养结果进行比较。结果:5份标本中均检测出海分枝杆菌,与培养结果一致。经过3～7个月治疗,4例患者治愈,1例患者好转。结论:用PCR-RFLP可以快速鉴定海分枝杆菌,有利于该类疾病的早期诊断和及时治疗。

牛附红细胞体病PCR诊断方法的建立

根据已报道的牛附红细胞体16S rRNA的序列设计1对特异性引物,进行PCR。将PCR产物克隆并测序,结果显示所得基因片段为667 bp,与GenBank上Mycoplasma wenyonii序列同源性达到98.83%。试验建立的PCR诊断方法特异性强,与健康牛血液、牛无乳链球菌、金黄葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌的DNA无交叉反应,能检测的牛附红细胞体最低DNA质量浓度是13.6 ng/L。应用该方法对130个奶牛血样进行牛附红细胞体病检测,结果表明总阳性感染率为24.62%。该方法具有快速、准确、敏感等特点,为牛附红细胞体病的诊断及分子流行病学的调查提供新的手段。

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法建立及初步应用研究

为建立一种特异、敏感的PEDV的检测方法。根据GenBank中公布的猪流行性腹泻病毒CV777株的M基因序列,设计了一对特异性引物,扩增长度为680bp的片段。将PCR产物进行测序,与CV777株、SH5株M基因的同源性分别为99.2%和97.6%。试验表明:该方法具有较好的特异性和敏感性,并能检测到PEDV的RNA浓度下限为100pg/μL。从福建省的3个地区共采集58份哺乳仔猪腹泻样品,并应用此方法进行检测,其阳性检出率为87.9%。

结核杆菌含信号肽的Mtb8.4真核表达质粒的构建及鉴定

目的 对结核杆菌新抗原—带信号肽的Mtb8.4(MS)进行基因克隆 ,构建其真核表达质粒并加以鉴定。 方法 采用聚合酶链反应 (PCR)从结核分枝杆菌H 3 7Rv株基因组中扩增出带信号肽的Mtb8.4(MS)目的基因 ,经HindⅢ和EcoRⅠ消化后 ,与 pcDNA3 .1(+ )载体进行连接重组。 结果 pcDNA3 .1(+ ) -MS真核表达质粒构建完成后 ,用限制性内切酶消化、PCR及DNA测序等多种方法进行鉴定 ,证实其构建成功。 结论 pcDNA3 .1(+ ) -MS真核表达质粒的成功构建 ,为进一步研究该质粒的免疫保护效果 ,了解信号肽序列在MS蛋白表达和分泌过程中所起的作用及制备相应的结核病DNA疫苗奠定了基础。