基于JNK-p62/SQSTM1信号通路探讨糖肾煎对2型糖尿病肾病大鼠足细胞的保护作用

目的 基于c-Jun氨基末端激酶(JNK)-p62/螯合体(SQSTM1)信号通路探讨糖肾煎对2型糖尿病肾病(DN)大鼠足细胞的保护作用。方法 SD大鼠随机分成正常组、DN组、糖肾煎低、中、高[生药5、10、20 g/(kg·d)]剂量组(糖肾煎-L、M、H组)、二甲双胍组[100 mg/(kg·d)]。除正常组外,其余各组通过喂养高脂高糖饲料和腹腔注射链脲佐菌素(STZ)进行DN模型构建。药物干预结束后,检测大鼠血生化指标空腹血糖(FBG)、负荷后2 h血糖(P2 h BG)、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)水平;苏木素-伊红(HE)、六胺银(PASM)染色观察肾组织病理学变化;透射电镜(TEM)观察肾小球基底膜损伤和足细胞变化情况;Western印迹检测肾组织中微管相关蛋白1A/1B-轻链(LC)3、p-JNK、JNK、p62/SQSTM1、肾病蛋白(Nephrin)蛋白表达。结果 与正常组比较,DN组FBG、P2 h BG、SCr、BUN水平及p62/SQSTM1蛋白表达明显升高,LC3-Ⅱ、Nephrin蛋白表达和p-JNK/JNK明显降低(P<0.05);光镜下观察到肾小球缩小、管丛系膜明显扩张,并有基底膜增生增厚等现象;TEM下观察到肾小球基底膜增厚、足细胞排列紊乱、形态改变、足突融合等现象。与DN组比较,糖肾煎-L、M、H组和二甲双胍组FBG、P2 h BG、SCr、BUN水平及p62/SQSTM1蛋白表达明显降低,LC3-Ⅱ、Nephrin蛋白表达和p-JNK/JNK明显升高(P<0.05);并且肾小球基底膜增厚、足细胞足突融合等情况均获得一定程度减轻。结论 糖肾煎对2型DN大鼠足细胞具有一定保护作用,可能是通过调控JNK-p62/SQSTM1信号通路,提高足细胞自噬,从而起到肾脏保护功效。

基于TGF-β_(1)/Smads信号通路探讨大蒜素对2型糖尿病大鼠肾纤维化的影响

目的:探讨大蒜素对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠肾纤维化和TGF-β_(1)/Smads信号通路的影响以及大蒜素对T2DM所致肾纤维化的作用机制。方法:将50只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组和大蒜素低剂量组(5 mg/kg)、大蒜素中剂量组(10 mg/kg)、大蒜素高剂量组(20 mg/kg),每组10只。正常对照组大鼠常规饲养,其余各组采用高糖高脂饲料喂养加腹腔注射链尿佐菌素的方法复制T2DM大鼠模型。造模完成后,大蒜素各剂量组大鼠腹腔注射相应剂量大蒜素溶液,正常对照组及模型组腹腔注射等剂量生理盐水,每天1次,共4周。干预4周后,测定各组大鼠空腹血糖水平,称量体质量;生化分析法测定24h尿蛋白(24 hour urine protein,24h UP)、血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血清肌酐(serum creatinine,SCr)表达水平;苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)进行肾组织病理学检查;Masson染色进行肾组织纤维化检查并计算胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF);免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)法检测肾组织中转化生长因子β_(1)(transforming growth factor-β_(1),TGF-β_(1))、磷酸化Smad2(phospho-Smad2,p-Smad2)、p-Smad3蛋白表达以及Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ,ColⅠ)和Ⅲ型胶原蛋白(collagenⅢ,ColⅢ)表达。结果:与正常对照组比较,模型组大鼠肾小球增大、系膜基质增厚、肾小管上皮细胞空泡变性、炎性细胞浸润,大鼠空腹血糖、24h UP、BUN、SCr、CVF、TGF-β_(1)、p-Smad2、p-Smad3、Col I、ColⅢ均升高,体质量下降;与模型组比较,大蒜素中、高剂量组大鼠空腹血糖水平降低、体质量升高(P<0.05),24h UP和血清BUN、SCr水平降低(P<0.01),病理学改变改善;与模型组比较,大蒜素低、中、高剂量组大鼠肾组织纤维化改善,肾组织CVF降低(P<0.01);与模型组比较,大蒜素中、高剂量组大鼠肾组织TGF-β_(1)、p-Smad2、p-Smad3、Col I、ColⅢ蛋白表达下调(P<0.01)。结论:大蒜素对T2DM大鼠肾纤维化具有抑制作用,其机制可能与大蒜素调控TGF-β_(1)/Smads信号通路进而抑制细胞外基质生成有关。

血流限制抗阻训练通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路减轻2型糖尿病大鼠肾纤维化

目的:探究血流限制抗阻训练对2型糖尿病(T2DM)大鼠肾纤维化的影响及其通过抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad家族成员3(Smad3)信号通路减轻肾纤维化的潜在机制。方法:采用高脂饲料和链脲佐菌素(STZ)联合制备大鼠T2DM模型,造模成功后随机分为T2DM对照(CON,n=5)组、低负荷抗阻训练(LRT,n=5)组、高负荷抗阻训练(HRT,n=5)组、血流限制(BFR,n=5)组和血流限制抗阻训练(BFRT,n=5)组,进行为期8周的运动训练。记录各组大鼠肾脏指数、空腹血糖(FBG)、血清肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)水平;通过HE和Masson染色观察肾脏形态学变化,并计算胶原容积分数(CVF);RT-qPCR检测肾脏组织中Klotho、TGF-β1和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA表达水平;Western blot检测肾脏组织中Klotho、TGF-β1、Smad3、磷酸化Smad3(p-Smad3)、α-SMA和结缔组织生长因子(CTGF)的蛋白水平。结果:对比其他各组,血流限制抗阻训练组大鼠FBG、SCr、BUN和肾脏CVF显著下降(P<0.05),Klotho表达水平显著上升(P<0.05),TGF-β1、p-Smad3、CTGF和α-SMA表达水平显著下降(P<0.05),Smad3表达水平无显著变化(P>0.05)。结论:血流限制抗阻训练可减轻T2DM大鼠肾纤维化程度,其机制可能与上调Klotho表达,阻断TGF-β1/Smad3信号通路,从而抑制细胞外基质的沉积有关。

过表达M2型肿瘤相关巨噬细胞TIA1基因通过调控PI3K/AKT信号通路抑制胃癌细胞侵袭和迁移

目的:探讨过表达M2型肿瘤相关巨噬细胞(M2-TAMs)T淋巴细胞内抗原1(TIA1)基因对胃癌BGC-823细胞侵袭和迁移的影响及其机制。方法:从胃癌组织中提取原代TAMs,采用IL-4和IL-13刺激TAMs诱导分化成M2-TAMs,再将TIA1基因过表达质粒(oe-TIA1)及其空载质粒(Vector)转染至M2-TAMs中,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中TIA1 mRNA和蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞中CD206和CD163表达水平;ELISA检测细胞培养上清液中IL-10、TGF-β、VEGF-A和Arg-1水平。通过Transwell共培养体系将转染后的M2-TAMs与胃癌BGC-823细胞共培养,并联用PI3K激动剂740Y-P进行干预,采用划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力;Western blot检测细胞中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、MMP-2和MMP-9等蛋白表达水平。结果:①与原代TAMs比较,M2-TAMs中CD206和CD163表达水平及细胞培养上清液中IL-10、TGF-β、VEGF-A和Arg-1水平均显著升高(P<0.05),而TIA1 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。TIA1基因过表达可显著降低M2-TAMs中CD206和CD163表达水平及细胞培养上清液中IL-10、TGF-β、VEGF-A和Arg-1水平(P<0.05)。②M2-TAMs中过表达TIA1基因可显著降低BGC-823细胞迁移和侵袭能力及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、MMP-2和MMP-9等蛋白表达水平(P<0.05)。③740Y-P可显著逆转M2-TAMs中过表达TIA1基因对BGC-823细胞迁移、侵袭及PI3K/AKT信号通路的抑制作用。结论:过表达M2-TAMs中TIA1基因表达可通过阻断PI3K/AKT信号通路影响胃癌细胞侵袭和迁移。

促愈熏洗方通过SOCS1介导JAK/STAT通路调控巨噬细胞M2型极化的机制研究

目的:探究促愈熏洗方通过细胞因子信号转导抑制蛋白1(SOCS1)介导Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)通路调控巨噬细胞M2型极化的作用机制。方法:用白细胞介素-4(IL-4)刺激巨噬细胞系RAW264.7,诱导巨噬细胞M2极化,RT-qPCR与Western blot检测SOCS1、SOCS2和SOCS3表达,筛选效应因子。脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞M1极化,分别用促愈熏洗方、siSOCSs处理细胞,检测M2型巨噬细胞表面标记分子(CD206、CD163)、相关炎症因子[IL-10、IL-13和转化生长因子β(TGF-β)]及JAK/STAT信号通路(STAT3、STAT6)表达。结果:与对照组比较,IL-4组细胞中SOCS1 mRNA及蛋白表达升高,SOCS3 mRNA及蛋白表达降低(均P<0.05),其中SOCS1表达变化最为显著。与对照组比较,IL-4组p-STAT3、p-STAT6、CD206和CD163蛋白表达及IL-10、IL-13、TGF-β含量升高(均P<0.05);与IL-4组比较,IL-4+siSOCS1组p-STAT3、p-STAT6、CD206、CD163及IL-10、IL-13、TGF-β降低(均P<0.05)。与对照组比较,LPS组CD206、CD163、IL-10、IL-13、TGF-β、p-STAT3、p-STAT6降低(均P<0.05);与LPS组比较,LPS+促愈熏洗方组SOCS1、CD206、CD163、IL-10、IL-13、TGF-β、p-STAT3、p-STAT6升高(均P<0.05);与LPS+促愈熏洗方组比较,LPS+促愈熏洗方+siSOCS1组SOCS1、CD206、CD163、IL-10、IL-13、TGF-β、p-STAT3、p-STAT6降低(均P<0.05)。结论:促愈熏洗方通过SOCS1激活JAK/STAT通路诱导巨噬细胞M2型极化。

M2型巨噬细胞衍生外泌体促进小胶质细胞M2型极化

背景:目前对于M2型巨噬细胞衍生外泌体的研究多集中于促进伤口愈合及成骨细胞的增殖和分化,而很少有研究关注其对小胶质细胞表型的调控作用。目的:探讨M2型巨噬细胞衍生外泌体对于小胶质细胞的表型调控作用及分子机制。方法:①提取骨髓原代巨噬细胞,用50 ng/m L白细胞介素4刺激巨噬细胞24 h促进巨噬细胞M2型极化,流式细胞术和细胞免疫荧光鉴定M2型巨噬细胞标志物CD206;②提取和鉴定M2型巨噬细胞衍生外泌体;③将小胶质细胞BV2随机分为3组:对照组、脂多糖组、治疗组,对照组不做处理,脂多糖组加入500 ng/m L脂多糖干预24 h,治疗组同时加入500 ng/m L脂多糖和25μg/m L M2型巨噬细胞衍生外泌体干预24 h,ELISA检测培养上清中肿瘤坏死因子α和白细胞介素10的分泌量,q RT-PCR检测细胞中诱导型一氧化氮合酶、精氨酸酶1、白细胞介素1β和白细胞介素10的m RNA表达,Western blot检测诱导型一氧化氮合酶、精氨酸酶1的蛋白表达以及核因子κB信号通路相关蛋白表达。结果与结论:①ELISA结果显示,与对照组相比,脂多糖组肿瘤坏死因子α分泌明显增多;与脂多糖组相比,治疗组肿瘤坏死因子α的分泌减少而白细胞介素10的分泌增多;②q RT-PCR结果显示,与对照组相比,脂多糖组白细胞介素1β、诱导型一氧化氮合酶m RNA表达升高;与脂多糖组相比,治疗组白细胞介素1β、诱导型一氧化氮合酶m RNA表达降低,白细胞介素10、精氨酸酶1 m RNA表达升高;③Western blot结果显示,与对照组相比,脂多糖组诱导型一氧化氮合酶蛋白表达升高;与脂多糖组相比,治疗组诱导型一氧化氮合酶蛋白表达降低,而精氨酸酶1蛋白表达升高;(4)与对照组相比,脂多糖组核因子κB信号通路中P65、p-IκB-α蛋白表达降低;与脂多糖组相比,治疗组P65、p-IκB-α蛋白表达升高。结果表明:M2型巨噬细胞衍生外泌体可以显著抑制脂多糖诱导小胶质细胞的炎症反应,促进抗炎因子白细胞介素10的表达,抑制促炎因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的表达,促进小胶质细胞表型由M1型向M2型极化,其机制可能与M2型巨噬细胞衍生外泌体抑制核因子κB信号通路激活有关。

2型糖尿病大鼠心肌PI3K/Akt/mTOR信号通路的改变及Sirt1的调控机制研究

目的检测Sirt1及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白在糖尿病大鼠心肌及高糖培养的H9C2细胞中的表达变化,明确其在糖尿病心肌病发生发展中的作用。方法高脂饮食联合链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型,实验将大鼠分为糖尿病2周、4周、8周模型组和对照组,超声心动图检测大鼠心功能变化,Western blot检测大鼠心肌Sirt1、PI3K、Akt、mTOR、S6K1蛋白表达变化。将H9C2细胞分为正常对照组、DMSO组(78.12 mmol·L^(-1))、高糖(HG)组(33 mmol·L^(-1))、白藜芦醇(Res)组(20μmol·L^(-1))、尼克酰胺(Nam)组(40 mmol·L^(-1)),Western blot及qRT-PCR研究心肌细胞Sirt1、PI3K、Akt、mTOR、S6K1相关蛋白基因转录及表达,研究Sirt1对该信号通路的调控机制。结果在动物实验中,与2周DM大鼠比较,8周DM大鼠心肌Sirt1蛋白表达明显增加。2周模型组大鼠相对于正常对照组心肌PI3K、Akt、mTOR、S6K1表达明显增加,且S6K1表达4周模型组比2周模型组增加更明显,但8周表达降低。在高糖培养的H9C2细胞中,与对照组相比,高糖组Sirt1,PI3K,Akt,mTOR和S6K1表达明显增高。Nam处理组Sirt1表达明显降低,PI3K,Akt,mTOR和S6K1表达增高。Res处理组Sirt1表达明显增高,而PI3K,Akt,mTOR和S6K1表达降低。结论 Sirt1通过负调控PI3K/Akt/mTOR信号通路参与糖尿病心肌损伤,参与早期糖尿病心肌病的发生发展。

mTOR Complex1-S6K1信号通路在2型糖尿病发生发展中的作用

随着人们生活水平的提高，全身代谢性疾病逐渐成为影响人类生活质量的主要疾病之一。在近年的调查研究中发现，糖尿病的发生率较过去20年间呈数倍增加，尤其糖尿病并发症引起的死亡率较前大大提升。所以深入研究糖尿病的发生、发展机制成为目前治疗糖尿病的关键。mTOR信号通路是雷帕霉素的靶分子，是丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，在感受营养信号、调节细胞生长和增殖中起关键性的作用。mTORComplexl-S6K1信号通路可受如生长因子、激素、能量信号等多种因素的调节，在糖尿病的发生、发展中起重要作用。本文将详细阐述mTORComplexl-S6K1信号通路在糖尿病的发生发展中的作用机制。

超声造影联合血清Ficolin-3,FOXM1对2型糖尿病下肢动脉病变的诊断价值分析

目的超声造影联合血清纤维胶凝蛋白-3(Ficolin-3)、叉头框蛋白M1(FOXM1)对2型糖尿病(T2DM)下肢动脉病变的诊断价值分析。方法选取2022年2月至2023年2月我院收治的T2DM患者114例,以下肢动脉血管造影检查为金标准,将患者分为下肢动脉病变组23例(病变组)和无下肢动脉病变组91例(T2DM组),另选取同期于本院进行体检的健康志愿者91例为对照组。对患者及健康志愿者进行血清Ficolin-3、FOXM1及超声造影检查;ROC曲线分析血清Ficolin-3、FOXM1对T2DM下肢动脉病变的诊断价值;采用四格表法分析血清Ficolin-3、FOXM1、超声造影及3项联合对T2DM下肢动脉病变的诊断价值。结果病变组、T2DM组血清Ficolin-3水平显著高于对照组,且病变组血清Ficolin-3水平显著高于T2DM组(均P<0.05);病变组、T2DM组血清FOXM1水平显著低于对照组,且病变组血清FOXM1水平显著低于T2DM组(均P<0.05);血清Ficolin-3诊断T2DM下肢动脉病变的曲线下面积为0.868,敏感度为86.96%,特异度为75.82%,最佳截断值为35.12μg/ml;血清FOXM1诊断T2DM下肢动脉病变的曲线下面积为0.854,敏感度为82.61%,特异度为78.02%,最佳截断值为0.57;血清Ficolin-3、FOXM1检查结果与金标准均具有中度一致性(Kappa=0.480、0.481,均P<0.001);超声造影检查结果显示,T2DM下肢动脉病变的阳性检出率为73.91%,与金标准具有较高一致性(Kappa=0.631,P<0.001);3项联合检测的敏感度、漏诊率均显著优于超声造影单独诊断,准确度显著优于Ficolin-3、FOXM1单独诊断,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论血清Ficolin-3、FOXM1联合超声造影检查在T2DM下肢动脉病变诊断中的应用价值较高,进一步提升了诊断的敏感度、准确度,减少了误诊率。

PKM2通过调控活性氧依赖的PI3K/Akt信号通路影响膀胱尿路上皮细胞癌细胞的侵袭能力

目的 探讨PKM2通过调控活性氧(ROS)依赖的PI3K/Akt信号通路对膀胱尿路上皮细胞癌细胞侵袭能力的影响。方法 将人膀胱癌T24细胞随机分为Control组、si-NC组、si-PKM2组和si-PKM2+IGF-1组。实时PCR检测细胞中PKM2 mRNA表达;CCK-8检测细胞增殖;Transwell小室法检测细胞侵袭和转移;Hoechst 33342荧光染色和流式细胞术检测细胞凋亡;ROS荧光探针法检测细胞中ROS水平;Western blotting检测细胞中PI3K、Akt、mTOR、caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达。结果 与人正常膀胱上皮SV-HUC-1细胞相比,人膀胱癌T24细胞中PKM2 mRNA相对表达量明显增加(P <0.05)。与Control组相比,si-PKM2组T24细胞中PKM2 mRNA相对表达量、细胞增殖能力、侵袭细胞数以及细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值和Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P <0.05),细胞凋亡率、细胞中ROS相对水平以及细胞中Bax、caspase-3蛋白表达水平明显升高(P <0.05);与siPKM2组相比,si-PKM2+IGF-1组T24细胞中PKM2 mRNA相对表达量、细胞增殖能力、侵袭细胞数以及细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值和Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P <0.05),细胞凋亡率、细胞中ROS相对水平以及细胞中Bax、caspase-3蛋白表达水平明显降低(P <0.05)。结论 敲减PKM2可促进膀胱尿路上皮细胞癌细胞中ROS水平升高,抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路激活,进而发挥抑制细胞侵袭和促进细胞凋亡作用。

β受体阻滞剂普萘洛尔介导VCAM1调节NF-κB信号通路改善大鼠缺血性心肌病

目的通过构建缺血性心肌病(ischemic cardio myopathy,ICM)大鼠模型,探讨普萘洛尔是否通过调节VCAM1/NF-κB信号通路改善ICM。方法将50只SD大鼠随机分为对照组(Control组)、缺血性心肌病组(ICM组)、普萘洛尔组(Propranolol组)、普萘洛尔+过表达对照组(Propranolol+ov-NC组)和普萘洛尔+过表达VCAM1组(Propranolol+ov-VCAM1组),每组10只。RT-qPCR检测大鼠心肌组织VCAM1 mRNA表达;Western blot检测大鼠心肌组织VCAM1、p-NF-κB和NF-κB蛋白表达;HE染色观察大鼠心肌组织病理形态变化;Masson染色观察大鼠心肌组织纤维化程度;免疫荧光观察大鼠心肌M1/M2型巨噬细胞比例;ELISA检测大鼠心肌组织IL-1β、IL-6和IL-10含量。结果对照组大鼠心肌纤维排列整齐,心肌间质未见水肿,心肌中几乎无胶原纤维分布;ICM组大鼠心肌可见纤维排列紊乱、间质水肿以及大量分布不均的胶原纤维;普萘洛尔组和普萘洛尔+ov-NC组大鼠心肌损伤和纤维化改善;普萘洛尔+ov-VCAM1组大鼠心肌损伤和纤维化较普萘洛尔组和普萘洛尔+ov-NC组加重。与对照组相比,ICM组大鼠心肌组织中VCAM1 mRNA和蛋白表达以及NF-κB磷酸化水平显著升高M1型巨噬细胞比例以及IL-1β和IL-6含量显著升高,M2型巨噬细胞比例以及IL-10含量显著降低;与ICM组相比,Propranolol组和Propranolol+ov-NC组大鼠心肌组织中VCAM1 mRNA和蛋白表达以及NF-κB磷酸化水平显著降低,M1型巨噬细胞比例以及IL-1β和IL-6含量显著降低,M2型巨噬细胞比例以及IL-10含量显著升高;与Propranolol组和Propranolol+ov-NC组相比,Propranolol+ov-VCAM1组大鼠心肌组织中VCAM1 mRNA和蛋白表达以及NF-κB磷酸化水平显著升高,M1型巨噬细胞比例以及IL-1β和IL-6含量显著升高,M2型巨噬细胞比例以及IL-10含量显著降低。结论普萘洛尔治疗通过下调VCAM1表达改善ICM大鼠心肌损伤和纤维化,其机制可能与抑制NF-κB磷酸化介导的M1型巨噬细胞极化有关。

M2型丙酮酸激酶、缺氧诱导因子-1α在子宫内膜癌组织中的表达及与患者临床特征的关系

目的探讨M2型丙酮酸激酶(PKM2)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在子宫内膜癌(EC)组织中的表达及与患者临床特征的关系。方法取41例EC患者的EC组织及相应癌旁组织和10例子宫内膜良性疾病患者的正常子宫内膜组织。采用免疫组化法检测PKM2、HIF-1α的表达情况。比较EC组织、癌旁组织及正常子宫内膜组织中PKM2、HIF-1α的阳性表达率及不同临床特征EC患者EC组织中PKM2、HIF-1α的表达情况。结果EC组织中HIF-1α的阳性表达率明显高于癌旁组织和正常子宫内膜组织,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。p53突变型、分化程度为低分化EC患者EC组织中PKM2的阳性表达率分别明显高于p53野生型、分化程度为中高分化患者,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。有脉管浸润的EC患者EC组织中HIF-1α的阳性表达率高于无脉管浸润患者,差异有统计学意义(P﹤0.05)。结论HIF-1α在EC组织中的阳性表达率较高。PKM2、HIF-1α表达与EC患者的临床特征有关,或可作为EC患者的有效治疗靶点。

泽泻汤基于PI3K/AKT通路调节巨噬细胞M1/M2极化平衡机制研究

目的:探讨泽泻汤(ZXT)对巨噬细胞M1/M2极化平衡的影响及可能的作用机制。方法:体内使用西式饮食(WD)诱导脂代谢紊乱小鼠模型,体外通过LPS/IL-4诱导RAW264.7细胞M1/M2型巨噬细胞模型,设置空白组、模型组、ZXT组。采用免疫荧光染色观察脂肪组织和RAW264.7细胞M1、M2型巨噬细胞标志物荧光强度;Western blot检测p-AKT、AKT、COX-2蛋白水平;qPCR分析M1、M2型巨噬细胞标志基因mRNA水平;ELISA测定IL-1β、IL-10分泌量;Griess法检测NO含量;Docking分析泽泻、白术活性成分与PI3K蛋白的结合情况。结果:与WD组相比,ZXT组CD11c表达显著减少,CD206表达量显著上调;ZXT逆转了LPS诱导的CD80表达升高,下调M1型巨噬细胞标志基因iNOS等mRNA水平,降低COX-2蛋白表达,抑制IL-1β分泌;ZXT促进IL-4诱导的CD206表达,上调M2型巨噬细胞标志基因Arg-1等mRNA水平及IL-10的分泌;ZXT逆转了LPS引起的NO释放增加;ZXT给药后体内外p-AKT/AKT蛋白水平均上升;Docking结果显示泽泻、白术中多个活性成分可与PI3K蛋白形成氢键稳定结合。结论:泽泻汤调节巨噬细胞M1/M2极化平衡,其作用机制可能与调控PI3K/AKT通路有关。

白虎汤联合中药石蜡疗法治疗2型糖尿病患者的临床疗效及对IRS-1/PI3K/Akt信号通路的影响

目的:探究白虎汤联合中药石蜡疗法对2型糖尿病患者的临床疗效及对胰岛素受体底物-1(IRS-1)/磷脂酰肌醇-3(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响。方法:选取2021年9月~2022年12月在我院内分泌科接受治疗的132例2型糖尿病患者的临床资料进行回顾性分析,根据治疗方式分为对照组(n=64)和观察组(n=68),在基础治疗后对照组给予中药石蜡疗法,观察组给予白虎汤联合中药石蜡疗法。连续治疗8周,比较两组治疗疗效、糖代谢[空腹血糖(FBG)、餐后2小时血糖(2hPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)]、氧化应激水平[超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)]、IRS-1/PI3K/Akt信号通路相关mRNA表达情况及不良反应发生率。结果:观察组治疗疗效高于对照组(85.29%vs 65.63%,P<0.05)。治疗后,两组FBG、HbA1c、OGTT、MDA含量较治疗前降低,且观察组显著低于对照组(P<0.05)。两组SOD、GSH及IRS-1、PI3K、Akt mRNA相对表达量较治疗前升高,且观察组显著高于对照组(P<0.05)。治疗过程中观察组不良反应发生率与对照组比较差异无统计学意义(3.13%vs 7.35%,P>0.05)。结论:白虎汤联合中药石蜡疗法能调节2型糖尿病患者糖代谢失衡,降低氧化应激水平,其作用机制可能与激活IRS-1/PI3K/Akt信号通路有关。

过表达miR-124-1基因的骨髓间充质干细胞外泌体调控小胶质细胞M2型极化对脑卒中的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)外泌体(exosomes,Exo)过表达miR-124-1基因(Exo/124-1)调控小胶质细胞(microglia,MG)的M2型极化对脑卒中的影响。方法分离培养大鼠BMMSCs,收集其Exo(BMMSCs-Exo),采用流式细胞术、Western blot与透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)分别对其进行检测鉴定。30只大鼠简单随机分为假手术组(Sham组)、模型组(MCAO/R组)、Exo移植组(Exo组)、空病毒(Empty lentivirus,Elv)转染Exo移植组(Exo-Elv组)及Exo/124-1移植组(Exo/124-1组),每组6只。Sham组仅行假手术,其余各组均复制大脑中动脉栓塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion and reperfusion,MCAO/R)模型。模型复制1 d与14 d后,各移植组动物于右侧脑室植入相应移植物,Sham组、模型组注入相同剂量生理盐水作对照。术后2 h及1、3、7、14、21、28 d,分别对各组动物行改良神经系统严重程度评分(modified neurological severity scores,mNSS)。三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色检测其梗死体积。在基因与蛋白水平分别检测各组28 d脑组织MG的M1型分子[肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]、M2型分子(CD206)的表达情况。结果成功获取并鉴定了BMMSCs及其Exo。Exo/124-1显著表达miR-124-1。所有动物(假手术组除外)术后出现神经功能缺损。术后7~28 d,Exo/124-1组的mNSS明显低于MCAO/R组(P<0.05)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01);术后28 d,Exo/124-1组的脑梗死体积、TNF-α的表达明显小于MCAO/R组(P<0.01)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01),CD206的表达显著高于MCAO/R组(P<0.01)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01)。结论BMMSCs-Exo携带miR-124-1基因可能调控MG的M2型极化,抑制M1型介导的炎症反应,促进脑卒中大鼠神经功能的恢复。

信号传导与转录激活子4信号通路在脂肪酶/Toll样受体4调控M1/M2型巨噬细胞分化的作用及机制

目的探讨信号传导与转录激活子4(STAT4)信号通路在脂肪酶(LPS)/Toll样受体4(TLR4)调控M1/M2型巨噬细胞分化的作用及机制。方法用野生型和STAT4-KO小鼠建立动脉内膜拉伤-增生模型,在术后1、3、7和14 d用流式细胞术分析免疫细胞M1/M2型巨噬细胞在外周血内的百分比变化。用免疫荧光双染检测M1,M2型巨噬细胞的表达。用实时荧光定量PCR(q-RT PCR)检测血管组织中STAT4和TLR4表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血管生长因子VEGF、PDGF-BB变化。从STAT4KO和蛋白质印迹法小鼠骨髓分离CD11b+细胞,用集落刺激因子GM-CSF和LPS处理,细胞实验分为WT con组、WT+LPS刺激组、STAT4KO con组、STAT4KO+LPS刺激组。观察巨噬细胞的分化情况。结果与野生组相比,STAT4-KO组在术后1、3、7和14天时M1型巨噬细胞F4/80+iNOS+,F4/80+IL-12的细胞百分比降低(P<0.05),而M2型巨噬细胞F4/80+Arg-1+和F4/80+CD206+的细胞百分比明显升高(P<0.05)。STAT4-KO组的M1,M2型巨噬细胞阳性表达率(9.42±0.41)%、(89.48±10.43)%与野生组(11.14±1.49)%、(48.73±5.89)%比较,差异有统计学意义(P<0.05)。STAT4和TLR4在STAT4-KO组[(0.23±0.04)、(0.47±0.06)]中的表达量明显较野生组[(1.31±0.07)、(0.89±0.08)]低(P<0.05)。VEGF、PDGF-BB在STAT4-KO组[(9.28±1.02)、(10.56±1.62)]中的表达量明显较野生组[(3.14±0.91)、(4.23±0.84)]高(P<0.05)。M2型巨噬细胞的诱导因子(IL-4)及分泌因子(IL-10)在STAT4KO+LPS刺激组、WT+LPS刺激组、STAT4KO con组中的表达量明显较WT con组高(F=13.412,F=15.012,P<0.05),其中STAT4KO+LPS刺激组表达量最为显著。结论STAT4信号通路可以促进抑制M1型巨噬细胞和增强M2型巨噬细胞分化。其作用机制可能是通过LPS/TLR4的结合。

Anosmin-1蛋白通过成纤维生长因子1型受体激活ERK1/2信号通路增强嗅鞘细胞的迁移

目的探究Anosmin-1蛋白对嗅鞘细胞迁移的影响及对成纤维生长因子(FGF)1型受体和ERK1/2信号通路的影响。方法选择SPF级成年雌性SD大鼠40只,7~10周龄,体重250~300 g。提取大鼠嗅球的嗅鞘细胞并纯化,纯化后细胞培养7 d后,采用随机数字表法将所有细胞平均分为四组:对照组(C组),FGF 1型受体激动剂(FGF2)组(F组),Anosmin-1蛋白组(A组)和Anosmin-1蛋白+FGF 1型受体抑制剂(Su5402)组(S组)。C组为空白对照组,培养液中不加任何药物处理;F组为阳性对照组,于培养液中加入FGF225 ng/ml;A组于培养液中加入Anosmin-1蛋白2 nmol/L;S组于培养液中加入Anosmin-1蛋白2 nmol/L和Su540230μmol/L。四组细胞处理24 h后,采用Transwell法检测嗅鞘细胞迁移能力,Western blot法检测嗅鞘细胞磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白、磷酸化AKT(p-AKT)蛋白和神经型钙粘连蛋白(N-cadherin)含量,免疫荧光染色法检测N-cadherin荧光强度。结果纯化后的嗅鞘细胞占总细胞的85.6%。与C组比较,F组和A组迁移至下室的嗅鞘细胞明显增多(P<0.05),p-ERK1/2蛋白、N-cadherin含量明显升高(P<0.05)。与A组比较,S组迁移至下室的嗅鞘细胞明显减少(P<0.05),p-ERK1/2蛋白、N-cadherin含量明显降低(P<0.05)。S组和C组间、F组和A组间迁移至下室的嗅鞘细胞数量、p-ERK1/2蛋白、N-cadherin含量差异无统计学意义。四组p-AKT蛋白含量差异无统计学意义。结论Anosmin-1蛋白通过FGF 1型受体激活ERK1/2信号通路,从而上调N-cadherin,增强嗅鞘细胞的迁移能力。

二烯丙基二硫通过磷酸化Chk1负调控Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路阻滞白血病K562细胞G_(2)/M期

目的:研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人白血病K562细胞周期阻滞及其分子机制。方法:采用CCK-8、细胞计数及流式细胞术观察DADS对K562细胞增殖与周期阻滞效应。Western Blot检测DADS对K562细胞PCNA、Chk1/2以及下游分子Cdc25C、CyclinB1与CDK1表达的影响。结果:CCK-8检测显示,15μmol/L、30μmol/L、60μmol/L、120μmol/L、240μmol/L DADS处理后,呈浓度依赖性抑制K562细胞增殖,抑制率分别为32.48%、59.34%、66.42%、77.06%、81.05%(P<0.05)。对照组与Tween80组无抑制作用(P>0.05)。细胞计数结果显示,30μmol/L、60μmol/L与120μmol/L DADS处理K562细胞后,群体倍增时间分别为22.71±0.29、36.69±0.93与73.02±0.87呈浓度依赖性增加(P<0.05),而Tween80组与对照组无明显差异(P>0.05)。流式细胞术检测显示,60μmol/L与120μmol/L DADS作用K562细胞24 h与48 h后,G_(2)/M期百分率分别增加到17.6%与28.5%和18.6%与34.4%,较对照组有显著性差异(P<0.05)。60μmol/L DADS作用K562细胞1 h、2 h、4 h、8 h和24 h后,PCNA表达呈时间依赖性表达下调(P<0.05)。p-Chk1表达呈时间依赖性上调(P<0.05),而Chk1、Chk2与p-Chk2表达无明显差异(P>0.05)。并且,Cdc25C、CyclinB1和CDK1分别呈时间依赖性下调(P<0.05),但是,14-3-3蛋白无明显改变(P>0.05)。结论:DADS可磷酸化Chk1通过Cdc25C/CyclinB1/CDK1通路抑制K562细胞增殖与阻滞G_(2)/M期。

胶质母细胞瘤中癌-睾丸抗原OY-TES-1的表达对M2型巨噬细胞极化的影响

目的探讨胶质母细胞瘤(GBM)中癌-睾丸抗原OY-TES-1的表达对M2型巨噬细胞极化的影响。方法体外培养人GBM细胞U251与人外周血单核细胞THP-1,构建稳定下调OY-TES-1的U251稳转株(U251-SH-OY-TES-1组),将转染无关序列的U251作为对照(U251-SH-NC组)。48h后取两组上清液与THP-1细胞共培养,加入U251-SH-NC组上清液的THP-1细胞为SH-NC组,加入U251-SH-OY-TES-1组上清液的THP-1细胞为SH-OY-TES-1组。通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹法分别检测两组OY-TES-1mRNA和蛋白相对表达量,确定转染效率。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养液中人白细胞介素-10(IL-10)、人转化生长因子-β(TGF-β)表达水平。通过流式细胞术检测CD206表达水平。结果RT-qPCR与蛋白免疫印迹法检测结果显示,U251-SH-OY-TES-1组OY-TES-1mRNA和蛋白的相对表达量低于U251-SH-NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA结果显示,两组培养液中TGF-β、IL-10水平随培养时间的增加呈上升趋势。第0天、第2天SH-OY-TES-1组培养液中TGF-β水平显著低于SH-NC组(P<0.05),IL-10水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。第4天SH-OY-TES-1组培养液中TGF-β、IL-10水平显著低于SH-NC组(P<0.05)。流式细胞术结果显示,与SH-NC组比较,SH-OY-TES-1组CD206水平下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论GBM中OY-TES-1高表达能够促进M2型巨噬细胞的极化。

宫颈癌组织中机械敏感离子通道蛋白1表达变化及M1/M2型巨噬细胞浸润情况观察分析

目的观察宫颈癌组织中机械敏感离子通道蛋白1(Piezo-type mechanosensitive ion channel component 1,Piezo1)的表达变化及M1/M2型巨噬细胞浸润情况,探讨其可能作用机制。方法选择病理明确诊断为宫颈癌患者的宫颈癌组织35例份、子宫肌瘤或子宫腺肌瘤行子宫全切患者正常宫颈组织30例份,分别采用免疫组织化学染色法及Western Blotting法检测Piezo1。从TCGA宫颈癌RNA-seq数据库中,使用R软件通过CIBERSORT法分析不同Piezo1表达的宫颈癌组织22种免疫细胞浸润情况,利用GSEA 4.2.3软件筛选1NES1>1、P<0.05、FDR<0.25的Piezo1巨噬细胞相关信号通路。采用免疫组织化学染色法和Pearson相关性分析法分析Piezo1表达与宫颈癌组织M1/M2巨噬细胞浸润的相关性。结果与正常宫颈组织相比,宫颈癌组织Piezo1相对表达量高(P<0.05)。宫颈癌组织和正常宫颈组织中M1巨噬细胞浸润强度为7.70±1.31、7.17±2.05(P>0.05),M2巨噬细胞浸润强度分别为16.21±6.36、3.89±1.56(P<0.05)。Piezo1表达与宫颈癌组织M2型巨噬细胞浸润水平成正相关(r=0.8617,P<0.001)。与Piezo1低表达者相比,Piezo1高表达的宫颈癌组织M2型巨噬细胞比例高(P<0.01)。Piezo1与M2型巨噬细胞极化细胞相关信号通路主要有IL6/JAK/STAT3信号通路、TGF-β信号通路及TNF-α/NF-κB信号通路。结论Piezo1在宫颈癌组织中高表达、M2巨噬细胞浸润多。Piezo1可能通过激活宫颈癌组织IL6/JAK/STAT3信号通路、TGF-β信号通路和TNF-α/NF-κB信号通路,促进M2型巨噬细胞极化,参与宫颈癌的发生发展。