CIITA M1-RNA抑制HeLa细胞表面MHC II类抗原的表达

探讨MHC II类转录激活因子(CIITA)的M1-RNA对细胞表面MHC II类分子表达的抑制。M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位,设计并克隆针对CIITA第452、629位点的M1-RNA(分别为M1-452-GS、M1-629-GS)及其相应的CIITA靶基因,分别插入pUC19、pGEM-7zf(+)载体,进行细胞外切割活性筛选。将细胞外切割作用明显的M1-629-GS亚克隆入psNAV载体(psNAV-M1-629-GS,pA629)并稳定转染HeLa细胞株,流式细胞术检测经典的MHC II类抗原(HLA-DR、-DP、-DQ)的表达,RT-PCR检测CIITA的mRNA水平。在重组人γ干扰素诱导下,pA629阳性HeLa细胞株表面HLA-DR、-DP抗原表达分别降低了83.03%及89.91%;同时CIITA的mRNA含量明显减少(P<0.05)。CIITA的M1-RNA抑制了自身mRNA含量,从而阻止其调控的MHC II类分子的表达,为移植物抗宿主病的研究提供了一种新方法。

CⅡTA M1-RNA对MHCⅡ类分子表达的抑制作用

目的探讨MHCⅡ类分子转录激活因子(CⅡTA)的M1-RNA对细胞表面MHCⅡ类分子表达的抑制。方法M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位,设计并克隆针对CⅡTA第452、629位点的M1-RNA(分别为M1-452-GS、M1-629-GS)及其相应的CⅡTA靶基因,分别插入pUC19、pGEM-7zf (+)载体,进行细胞外切割活性筛选。将细胞外切割作用明显的M1-629-GS亚克隆入psNAV载体(psNAV-M1-629-GS,pA629)并稳定转染ECV304细胞株,流式细胞术检测经典的MHCⅡ(HLA-DR、-DP、-DQ)类抗原表达,RT-PCR检测CⅡTA的mRNA水平。结果pA629阳性ECV304细胞株与对照组比较,HLA-DR、-DP抗原表达分别降低了89.21%及92.31%;同时CⅡTA的mRNA含量降低(P<0.05)。结论CⅡTA的M1-RNA(M1-629-GS)降低了自身mRNA含量,从而阻止其调控的MHCⅡ类分子的表达。

沉默RRM1可逆转乳腺癌细胞MCF-7/R对紫杉醇的耐药性

目的阐明沉默核苷酸还原酶M1亚基(RRM1)对乳腺癌耐药细胞MCF-7/R逆转耐药的作用。方法通过高浓度紫杉醇诱导耐药株MCF-7/R;运用Kaplan-Meier Plotter绘制RRM1基因的生存曲线;通过siRNA沉默MCF-7/R细胞中RRM1基因表达,并用Western blot和qRT-PCR方法检测蛋白和基因水平的表达,筛选出高效特异的si-RRM1序列;将该si-RRM1序列转染MCF-7/R细胞,筛选得到能稳定抑制RRM1基因表达的细胞株MCF-7/R/siRNA;四甲基偶氮唑盐(MTT)法和5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色法检测RRM1沉默后MCF-7/R细胞增殖能力的变化;流式细胞术检测细胞周期和凋亡,并观察周期、凋亡相关蛋白的变化;构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察沉默RRM1后给予紫杉醇治疗对裸鼠体内抑瘤效果的影响。结果生存曲线分析显示RRM1基因表达与乳腺癌患者的生存率呈负相关(P=0.000);MCF-7/R细胞中证实RRM1蛋白和mRNA表达水平较MCF-7细胞均显著升高(P<0.01);si-RRM1序列筛选中,转染si-RRM1-04组细胞的RRM1蛋白和mRNA表达量降低最为显著(P<0.001);沉默RRM1后,MCF-7/R细胞对紫杉醇的敏感性显著增加,细胞晚期凋亡比例明显升高(P<0.001),同时降低Akt蛋白的磷酸化并抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达,促进p53蛋白表达水平的增加(P<0.001);裸鼠实验显示,与si-NC组相比,沉默RRM1后给予紫杉醇治疗可显著抑制裸鼠体内肿瘤的生长(P<0.001)。结论沉默RRM1可通过诱导细胞凋亡增加提高MCF-7/R细胞化疗敏感性,逆转乳腺癌紫杉醇化疗耐药。

RNA干扰抑制nm23-M1基因表达对骨髓瘤SP2/0细胞增殖的影响

建立RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制nm23-M1基因表达的骨髓瘤SP2/0细胞株,初步探讨nm23-M1基因对小鼠骨髓瘤细胞增殖的影响。针对nm23-M1 mRNA序列设计3个小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列,分别构建表达这3个序列及阴性对照序列的pGenesil-1重组质粒,再转染小鼠骨髓瘤SP2/0细胞并经G418抗性筛选稳定表达细胞株。采用半定量RT-PCR及Western印迹检测3个重组质粒对nm23-M1 mRNA及蛋白质表达的抑制效果,然后用MTT法观察抑制nm23-M1表达对SP2/0细胞增殖的影响。结果显示,设计的3条siRNA不同程度地特异抑制骨髓瘤SP2/0细胞nm23-M1 mRNA及蛋白质的表达,其中siRNA-2抑制作用最强,其对nm23-M1 mRNA和蛋白质的抑制率分别为74.4%和62.1%;且siRNA-2抑制nm23-M1基因表达后SP2/0细胞增殖受到明显抑制(P<0.05)。本研究成功构建了pGenesil-1-nm23-M1 siRNA重组质粒,筛选出稳定抑制nm23-M1基因表达的SP2/0细胞株,提示抑制nm23-M1基因表达有抑制骨髓瘤细胞增殖的作用;为进一步研究nm23基因的生物学功能及临床应用打下了基础。

肿瘤抑制候选基因-7、叉头框转录因子M1、鳞状细胞癌抗原在食管癌中的表达及意义分析

目的探讨长链非编码RNA肿瘤抑制候选基因-7(LncRNATUSC7)、叉头框转录因子M1(Foxm1)、鳞状细胞癌抗原(SCC-Ag)在食管癌中的表达及意义。方法我院收治的78例食管癌患者,根据肿瘤分期分为早中期组(TNM分期Ⅰ~Ⅱ期)32例与中晚期组(TNM分期Ⅲ~Ⅳ期)46例,比较两组LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表达水平,分析LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表达水平与食管癌肿瘤分期的相关性以及对食管癌肿瘤分期评估效能。结果中晚期组LncRNATUSC7水平低于早中期组,Foxm1、SCC-Ag水平高于早中期组(P<0.05)。食管癌患者LncRNATUSC7水平与肿瘤分期呈负相关,Foxm1、SCC-Ag水平与肿瘤分期呈正相关(P<0.05);三项指标评估食管癌肿瘤分期的ROC曲线AUC分别为0.914、0.871、0.795,截断值分别为0.27、1.40、5.15 ng/ml。结论不同肿瘤分期的食管癌患者LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表达水平存在明显差异,且三项指标可有效反映食管癌患者病情进展程度,可用于该病患者病情监测及治疗指导,临床应用价值较高。

抗CⅡTA核糖核酸酶P抑制Daudi细胞表面MHC-Ⅱ类抗原的表达

探讨抗MHC-Ⅱ类分子转录激活因子(CⅡTA)的核糖核酸酶P对Daudi细胞表面MHC-Ⅱ类分子表达的抑制作用.M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位.以pTK117质粒为模板,PCR扩增带有抗CⅡTA第452及629位点的引导序列的M1-RNA(M1-452-GS及M1-629-GS),再分别插入pUC19载体(pUC19-M1-452-GS和pUC19-M1-629-GS).从Raji细胞中克隆CⅡTA基因DNA片段(114～800)后插入pGEM-7zf(+)质粒.将重组M1-RNA与靶基因的mRNA进行细胞外共孵育,显示仅pUC19-M1-629-GS可特异性地切割靶基因mRNA.再将M1-629-GS克隆入psNAV载体(pA629)并稳定转染Daudi细胞株,RT-PCR检测其CⅡTA的mRNA水平,流式细胞术检测其HLA-DR、DP、DQ抗原表达.与对照组比较,M1-629-GS阳性Daudi细胞的CⅡTAmRNA含量减少90.19%(P<0·05),其HLA-DR、DP、DQ抗原表达分别降低91.97%、90.19%、92.36%(P<0·05).研究表明,抗CⅡTA的核糖核酸酶P可通过抑制CⅡTA的转录而降低Daudi细胞表面的MHC-Ⅱ类分子的表达.

抗CⅡTA的核糖核酸酶P对Jurkat细胞MHCⅡ类分子表达的抑制作用

本研究旨在探讨抗MHCⅡ类分子转录激活因子(CⅡTA)的M1-RNA抑制细胞表面MHCⅡ类分子的表达。M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位,设计并克隆针对CⅡTA第3408位点的M1-RNA(M1-3408-GS)及其相应的CⅡTA靶基因片段(3176-3560),分别插入pUC19、pGEM-7zf(+)载体,进行细胞外切割活性筛选。将细胞外切割作用明显的M1-3408-GS亚克隆入psNAV载体并稳定转染Jurkat细胞株,采用流式细胞术检测该细胞表面经典的MHCⅡ(HLA-DR、-DP、-DQ)类抗原表达,RT-PCR检测其CⅡTA的mRNA水平。结果表明:在重组人干扰素(IFN)-γ诱导下,M1-3408-GS阳性Jurkat细胞株与对照组比较,其表面HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ抗原诱导型表达分别降低了83.17%、94.12%及84.31%;同时CⅡTA的mRNA含量明显降低(P<0.05,t=4.89)。结论:抗CⅡTA的M1-RNA(M1-3408-GS)降低了自身mRNA含量,从而阻止其调控的MHCⅡ类分子的表达。

叉头框转录因子M1蛋白在食管鳞癌细胞和组织中的表达及意义

目的探讨叉头框转录因子M1（FoxM1）蛋白在食管鳞癌细胞和组织中的表达及意义。方法采用Westernblot法检测正常食管上皮细胞（HEEC）以及食管鳞癌细胞（TE1、TE10、TE11和Eca109）中FoxM1蛋白的表达。通过RNA干扰技术敲低食管鳞癌TE1细胞中FoxM1蛋白的表达，采用四甲基偶氮唑蓝法、划痕实验及Transwell侵袭实验检测敲低FoxM1蛋白表达对TE1细胞增殖、迁移和侵袭的影响。建立裸鼠移植瘤模型，观察敲低FoxM1蛋白表达对移植瘤生长的影响。采用免疫组化法检测99例食管鳞癌组织及其癌旁组织中FoxM1蛋白的表达，分析FoxM1蛋白的表达与食管鳞癌患者临床病理特征及预后之间的关系。结果正常食管上皮细胞中几乎检测不到FoxM1蛋白，而4种食管鳞癌细胞株中FoxM1蛋白均过表达，其中TE1细胞中FoxM1蛋白表达强度最高。敲低TE1细胞中FoxM1蛋白的表达可明显抑制TE1细胞的生长、迁移和侵袭能力；并使裸鼠的成瘤能力降低，接种后35d，干扰组和阴性对照组裸鼠移植瘤的肿瘤体积分别为（1．17±0．30）cm3和（2．32±0．18）cm3，差异有统计学意义（P〈0．01）；肿瘤重量分别为（0．36±0．05）g和（1．07±0．07）g，差异亦有统计学意义（P〈0．05）。FoxM1蛋白在99例食管鳞癌组织和癌旁组织中的阳性表达率分别为61．6％（61／99）和24．2％（24／99），FoxM1蛋白在肿瘤组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织（P〈0．05）。FoxM1蛋白在食管鳞癌组织中的表达与淋巴结转移、临床分期和浸润深度有关（均P〈0．05）。38例FoxM1蛋白阴性表达组患者的中位生存时间为42．3个月，61例FoxM1蛋白阳性表达组患者的中位生存时间为33．0个月，差异有统计学意义（P=0．036）。结论FoxM1蛋白在食管鳞癌细胞和组织中高表达，其表达水平与食管鳞癌的发生、发展及预后关系密切。FoxM1可作为食管鳞癌预后的指标和潜在的治疗靶点。

RNA干扰下调叉头转录因子M1基因对人肿瘤细胞生长、克隆和侵袭的影响

目的 观察RNA干扰下调叉头转录因子M1（FoxM1）基因对肿瘤细胞生长、克隆形成和侵袭的影响。方法 培养8株人卵巢癌细胞,采用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）方法检查FoxM1基因mRNA水平。设计并用化学方法合成FoxM1基因小干扰RNA（siRNA）,转染处理SKOV-3细胞,选择下调效果最好的siRNA。SKOV-3和HO-8910PM细胞均分为3组：空白对照组（Con-A）、空载质粒对照组（Con-B）和siRNA组（siRNA）,其中,siRNA组以FoxM1 siRNA转染处理。分别应用FQ-PCR和Western blot方法检测各组癌细胞FoxM1基因mRNA和蛋白水平。以细胞计数试剂盒（CCK-8）方法检测生长,以平板克隆方法检测癌细胞克隆形成能力,以Transwell方法检测癌细胞侵袭能力。结果 8株卵巢癌细胞株中,SKOV-3和HO-8910PM细胞FoxM1基因mRNA表达水平最高。FoxM1基因siRNA转染SKOV-3细胞后,72 h Con-A、Con-B和siRNA组吸光度（A）值分别为2.455±0.033、2.442±0.025和1.312±0.028（P〈0.05）,平板克隆结果显示,Con-A、Con-B和siRNA克隆形成数分别为（100±5）、（93±8）和（51±3）个（P〈0.05）,Transwell结果显示,Con-A、Con-B和siRNA组穿膜细胞数分别为（93±4）、（86±3）和（36±1）个（P〈0.05）。FoxM1基因siRNA转染HO-8910PM细胞后,72 h,Con-A、Con-B和siRNA组A值分别为2.691±0.039、2.560±0.033和1.455±0.027（P〈0.05）,平板克隆结果显示,Con-A、Con-B和siRNA克隆形成数分别为（146±7）、（145±8）和（85±2）个（P〈0.05）,Transwell结果显示,Con-A、Con-B和siRNA组穿膜细胞数分别为（449±15）、（445±11）和（151±9）个（P〈0.05）。结论 FoxM1基因在人卵巢癌细胞生长、增殖和侵袭起重要作用。

siRNA沉默FOXM1基因表达对人鼻咽癌细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响

目的:研究特异性siRNA沉默转录因子叉头框M1(forkhead box M1,FOXM 1)基因表达对人鼻咽癌细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响,并探讨其相关的分子机制。方法:将特异性靶向FOXM 1基因的siRNA(FOXM1-siRNA)转染至鼻咽癌5-8F细胞后,采用RT-PCR、实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测FOXM 1基因表达沉默效果。然后采用MTT法、FCM法、AnnexinⅤ-FITC/PI双染法和蛋白质印迹法分别检测FOXM 1基因表达沉默后鼻咽癌细胞增殖、周期分布、凋亡和紫杉醇敏感性的变化,以及相关蛋白的表达。结果:FOXM1-siRNA转染后5-8F细胞中FOXM1 mRNA及蛋白的表达水平明显降低(P值均<0.01)。FOXM 1基因表达沉默后,5-8F细胞的增殖活性明显降低(P<0.05),增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表达水平明显降低(P<0.01);同时,G1期细胞所占比例明显升高(P<0.01),S期细胞所占比例降低(P<0.05),Cyclin D1表达下调(P<0.01);细胞凋亡率明显升高(P<0.01),Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax表达上调(P<0.01);细胞对紫杉醇的敏感性明显增强(P<0.01),多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1,MRP1)表达水平降低(P<0.01)。结论:特异性siRNA沉默FOXM 1基因表达可抑制鼻咽癌5-8F细胞的增殖,诱导细胞凋亡,并提高细胞对紫杉醇的敏感性;其机制可能与下调PCNA、Cyclin D1、MRP1和Bcl-2表达,以及上调Bax表达有关。

靶向FoxM1基因的短发夹RNA干扰表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向FoxMl基因的短发夹RNA（shRNA）干扰表达载体质粒，为进一步探讨FoxMl在肺部恶性肿瘤及其他疾病中的作用奠定基础。方法化学合成可编码靶向FoxMl基因的siRNA的短发夹DNA（shDNA）片段，通过基凶重组将其插入到线性化的shRNA表达质粒骨架pSilencer2．1-U6中，对得到的新质粒进行酶切鉴定和基因测序。结果所构建的质粒载体中成功插入了可编码靶向FoxMl基因的siRNA的shDNA片段。结论成功构建了靶向FoxMl基因的shDNA表达载体。

靶向C区基因的M1GS RNA核酶胞内抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的探讨靶向作用于乙型肝炎病毒C区基因的M1GS RNA核酶胞内抗乙型肝炎病毒的作用。方法设计并应用PCR技术合成M1RNA核酶，应用pEGFP-C1载体构建M1GSRNA核酶的真核表达质粒，应用脂质体Lipofectamine TM 2000转染HepG2．2．15细胞，以ELISA法检测细胞培养液中病毒抗原，以反转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）检测细胞内病毒mRNA，以荧光定量PCR法检测分泌入培养液的HBVDNA含量，用MTT法检测核酶对细胞增殖活性的影响。结果质粒载体表达的M1GS RNA核酶能明显抑制细胞培养液中HBeAg的表达及病毒mRNA的表达，抑制率分别为31．58％，32．5％。但M1GS RNA核酶对培养液中的HBV DNA含量无明显影响，亦不影响HepG2．2．15细胞的增殖活性。结论M1GS RNA核酶能特异性抑制HepG2．2．15细胞内HBV C区基因表达，是一种很有潜力的抗HBV基因治疗方法。

叉头盒蛋白M1的表达水平与结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移的关系

叉头盒蛋白M1(forkhead box protein M1,FOXM1)是细胞分化和增殖的重要调节因子,目前已经证实FOXM1在多种肿瘤细胞中高度表达,然而其在结直肠癌细胞中的作用尚不明确。为了揭示FOXM1的表达水平与结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移的关系,本研究检测了53例结直肠癌患者的肿瘤组织和邻近非癌组织中的FOXM1表达水平。此外,应用FOXM1 siRNA转染人结直肠癌细胞系SW620,并考察FOXM1敲低对细胞增殖、侵袭和迁移的影响。免疫组化结果显示,92.45%的结直肠癌组织为FOXM1高表达(49/53),18.87%的相邻非癌组织为FOXM1高表达(10/53),FOXM1在不同组织间差异显著(χ^2=58.141,p=0.001)。QRTPCR和Western blotting分析显示,结直肠癌组织中FOXM1的m RNA和蛋白表达水平显著高于邻近非癌组织(p<0.05)。此外,siRNA敲低SW620细胞中FOXM1的表达后,CCK8检测显示FOXM1沉默显著降低SW620细胞的增殖活性;Transwell测定和细胞划痕愈合结果显示,FOXM1沉默显著降低细胞的侵袭和迁移能力(p<0.05)。表明FOXM1可能介导结直肠癌的发病机制,其有望成为结直肠癌分子治疗的有效靶点。

硫链丝菌肽下调FOXM1的表达对肺癌细胞生长及凋亡的影响

目的 探讨硫链丝菌肽（TST）对肺癌细胞A549增殖、凋亡及其对AG1478 （EGFR-TKI）药物敏感性的影响.方法 CCK-8法检测TST、AG1478单药及两药联用后A549细胞的增殖抑制率;Western blot检测TST对叉头转录因子M1（FOXM1）表达的影响;Caspase-3比色测定法检测TST对Caspase-3活化程度的影响;利用RNAi技术沉默A549细胞中FOXM1基因,检测FOXM1及增殖凋亡相关分子表达变化.结果 TST增加A549细胞对肺癌靶向药物AG1478的敏感性,其IC50值由（4.35±0.45） μmol/L降至（0.73±0.05） μmol/L（t=11.02,P＜0.05）;TST抑制FOXM1及下游c-Myc、Cyclin B1、Bel-2分子的表达,上调P21、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP表达的同时,呈时间及剂量依赖性诱导Caspase-3分子活化;沉默FOXM1后其下游分子c-Myc、Cyclin B1、Bcl-2、P21及Cleaved PARP的表达改变同TST作用后相似,细胞中Cleaved Caspase-3的荧光表达明显增多.结论 TST介导的FOXM1下调可抑制A549细胞增殖,诱导其凋亡,并增加其对AG1478的药物敏感性.

长链非编码RNA LOC653786诱导肺癌细胞抵抗吉西他滨的信号机制研究

目的观察长链非编码RNA(LncRNA)LOC653786在肺癌细胞吉西他滨耐药中的作用及机制。方法构建吉西他滨耐药肺癌细胞A549(A549/GR),MTT法检测细胞增殖能力;RT-qPCR检测LOC653786表达水平;siRNA转染法沉默LOC653786或FOXM1表达;免疫荧光检测转染细胞荧光表达情况;蛋白印记实验检测FOXM1、MRP1和P-gp蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果A549/GR细胞构建完成,耐药指数为6.0。相较于A549细胞,A549/GR细胞LOC653786表达水平显著升高(P<0.01),FOXM1、MRP1和P-gp蛋白表达明显上调(P<0.01)。沉默LOC653786显著下调A549/GR细胞FOXM1、MRP1和P-gp蛋白表达(P<0.01)。沉默FOXM1蛋白表达可显著下调A549/GR细胞MRP1和P-gp蛋白表达(P<0.01)。沉默LOC653786或FOXM1均可增强吉西他滨诱导的A549/GR细胞凋亡(P<0.01)。结论LncRNA LOC653786能介导FOXM1蛋白表达,从而诱导MRP1和P-gp蛋白表达上调,最终参与吉西他滨耐药。