冬凌草甲素逆转黑色素瘤细胞顺铂耐药的作用及机制

目的:探讨冬凌草甲素(Ori)逆转人黑色素瘤细胞顺铂(DDP)耐药的作用及其机制。方法:分别将黑色素瘤DDP耐药细胞A375/DDP和M14/DDP分为对照组、2μmol/L Ori组、4 mg/L DDP组和2μmol/L Ori+4 mg/L DDP组。CCK-8法、Transwell实验、Annexin Ⅴ-FITC/PI染色流式细胞术分别检测各组细胞的增殖活力、侵袭和迁移能力及凋亡水平,透射电子显微镜观察自噬小体,免疫荧光染色法观察微管相关蛋白轻链3(LC3)点状结构,WB法检测A375/DDP细胞自噬相关蛋白Beclin-1、p62、LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的表达。结果:与4 mg/L DDP组相比,2μmol/L Ori+4 mg/L DDP组细胞增殖活力、迁移和侵袭能力均显著下降(均P<0.01),凋亡水平显著升高(P<0.01)。4 mg/L DDP组细胞中可见大量自噬小体以及LC3点状染色,但2μmol/L Ori+4 mg/L DDP组仅可见少量。与对照组相比,4 mg/L DDP组细胞中Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达水平均显著升高(均P<0.01),p62的蛋白表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01);与4 mg/L DDP组相比,2μmol/L Ori+4 mg/L DDP组细胞中Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达水平均显著降低(均P<0.01),p62的表达水平显著升高(P<0.05)。结论:Ori可增加耐药黑色素瘤细胞对DDP的敏感性,此作用可能与其抑制DDP引起的细胞自噬有关。

miR-203调控锌指蛋白281表达对黑素瘤细胞增殖、迁移的影响

目的初步探究微小RNA-203(miR-203)调控锌指蛋白281(ZNF281)对黑素瘤细胞增殖、迁移的影响。方法常规培养人血管内皮细胞系ECV304、人黑素瘤细胞系A375、M14、SK-MEL-28、SK-MEL-2,实时荧光定量PCR检测各细胞系中miR-203表达情况,Western免疫印迹法检测各细胞系中ZNF281蛋白水平。A375、M14细胞分别分为5组:对照组(细胞正常培养)、miR-203模拟物对照组(加入miR-203模拟物阴性对照)、miR-203抑制剂对照组(加入miR-203抑制剂阴性对照)、miR-203模拟物组(加入miR-203模拟物)、miR-203抑制剂组(加入miR-203抑制剂)。实时荧光定量PCR检测各组A375、M14细胞中miR-203的表达,CCK8法检测各组A375、M14细胞增殖活性,Transwell实验检测各组A375、M14细胞迁移数量,Western免疫印迹法检测各组A375、M14细胞中ZNF281蛋白的表达。双荧光素酶验证miR-203与ZNF281的靶向关系。多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q法。结果与血管内皮细胞系ECV304相比,黑素瘤细胞系A375、M14、SK-MEL-28、SK-MEL-2中miR-203表达水平较低(均P<0.05),ZNF281蛋白水平较高(均P<0.05)。与对照组、miR-203模拟物对照组、miR-203抑制剂对照组相比,miR-203模拟物组A375、M14细胞中miR-203水平均显著升高(F=487.632、68.454,均P<0.05),细胞迁移数量均显著降低(均P<0.05),ZNF281蛋白表达均显著降低(均P<0.05);miR-203抑制剂组A375、M14细胞中miR-203表达均显著降低(均P<0.05),细胞迁移数量均显著增加(均P<0.05),A375细胞中ZNF281蛋白表达显著升高(均P<0.05),36、48、60、72 h A375细胞增殖活性显著升高(均P<0.05),24、36、48、60、72 h M14细胞增殖活性均显著升高(均P<0.05)。miR-203与ZNF281之间存在靶位点。结论上调miR-203表达可抑制黑素瘤细胞增殖、迁移,下调miR-203表达可促进黑素瘤细胞增殖、迁移,可能通过调控ZNF281的表达实现。

黑素瘤细胞培养上清液对人单核细胞体外IL-12产生和CD14、CD1a表达的影响

目的探讨M14黑素瘤细胞培养上清液(MCS)在体外对人外周血单核细胞分泌白介素12 (IL-12)以及单核细胞向树突细胞分化的影响。方法分离并获得人外周血单核细胞,添加不同量的MCS与单核细胞共培养,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测单核细胞IL-12的分泌情况;将MCS与单核细胞连续5d共培养,用流式细胞仪分析单核细胞表面CD14、CD1a的表达情况。结果MCS对单核细胞分泌活性的影响呈浓度依赖关系,随MCS添加量的逐渐增加(25-100μL),单核细胞分泌IL-12的量则呈逐渐降低趋势(158.40±21.37 pg/mL-56.90±15.60 pg/mL,P<0.05);同时MCS妨碍单核细胞由CD14表型(5.47%±1.00%-17.87%±2.40%,P<0.01)向树突细胞CD1a表型(41.00%±2.12%-20.00%±4.24%,P<0.01)转化;且MCS抑制单核细胞IL-12分泌和抑制单核细胞向树突细胞表型转化的作用均能被细胞外信号调节激酶(ERK)特异性抑制剂(PD98059)所逆转(分别为:172.63±8.88 pg/mL,P<0.05; 8.67%±0.47%,P<0.05;36.67%±0.71%,P<0.05)。结论MCS可能通过分泌ERK刺激因子对单核细胞分泌IL-12p40和单核细胞分化起到抑制作用。

AY358935基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建AY358935基因的真核表达质粒并进行初步鉴定。方法以逆转录聚合酶链反应（reverse transcription—polymerase chain reaction，RT-PCR）扩增AY358935基因的cDNA，将该片段克隆进pGEM-Teasy载体；以测序正确的pGEM-T-AY重组质粒为模板构建pcDNA3．1-Ay真核表达质粒，并进行双酶切鉴定。以pcDNA3．1-Ay瞬时转染M14细胞，Western印迹法和3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di_phenytetrazoliumromide，MTT]比色法分别检测转染细胞AY358935蛋白表达水平及细胞增殖力。结果RT-PCR扩增片段符合AY358935基因cDNA大小，与pcDNA3．1诅y克隆区酶切片段-致。对pGEM-T-AY质粒克隆区测序，结果也与AY358935基因cDNA序列相同。M14细胞分别转染AY358935基因、peDNA3．1和脂质体48h后，AY358935基因组蛋白表达水平明显高于其余两组，且AY358935基因组细胞A值（0．74）也明显高于其余两组（0．39和0．46），差异有统计学意义（P〈0．05）。结论AY358935基因的真核表达质粒pcDNA3．1-Ay构建成功，AY358935基因可能具有促进M14细胞增殖的作用。