灵孢多糖对M146L细胞APP mRNA表达的影响研究

目的:探讨灵孢多糖(GLPS)对M146L细胞APP mRNA表达的影响,寻找潜在的能够抑制Aβ分泌的中药单体,以达到治疗阿尔茨海默病(AD)的目的。方法:以可过表达β淀粉样蛋白42(Aβ_(42))的β淀粉样蛋白前体蛋白(APP)/突变型早老素1(PS1)双转基因的CHO细胞(M146L细胞)为体外AD治疗药物筛选模型。经不同浓度的GLPS(100,200,300μg/mL)处理后,采用MTT比色法检测细胞活性;应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测灵孢多糖对M146L细胞APP mRNA表达的影响;蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测M146L细胞中APP,Aβ_(42),Bax,Bcl-2等蛋白表达情况;酶联免疫吸附法(ELISA)检测M146L细胞外Aβ_(42)的表达情况。结果:低、中剂量GLPS组细胞活性与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);高剂量GLPS组相比于对照组,细胞活性明显下降(P<0.05)。相比于对照组,低、中、高剂量GLPS组APP mRNA,APP,Aβ_(42),Bax表达水平及细胞外Aβ_(42)浓度均降低(P<0.05),Bcl-2表达水平均升高(P<0.05),且呈一定浓度依赖性(P<0.05)。结论:GLPS可抑制M146L细胞表达APP mRNA,具有成为治疗AD药物的潜质。

五味子乙素对M146L细胞分泌β淀粉样蛋白的影响

目的:探讨五味子乙素对M146L细胞分泌的β淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ)的影响。方法:体外培养稳定转染人类阿尔茨海默病β淀粉样前体蛋白(Amyloid beta-protein precursor,APP)基因及突变型早老素1(prsenilin-1,PS1)基因的CHO(Chinese Hamster Ovary)细胞系(M146L),使之高效产生β淀粉样蛋白42(amyloid β-protein,Aβ_(42)),建立Aβ_(42)过度表达的细胞模型。加入待筛选的药物五味子乙素,用四甲基偶氮唑蓝比色法(microculture tetrazolium assay,MTT法)检测不同浓度的五味子乙素(1.67,5,15μg·mL^(-1))对M146L细胞毒作用,应用ELISA法(enzyme-linked immunosorbent assay)观察细胞分泌的Aβ_(42)的变化。结果:不同浓度的五味子乙素对M146L存活率没有影响,不具有细胞毒作用。5和15μg·mL^(-1)的五味子乙素对细胞分泌的Aβ_(42)有抑制作用,以高剂量组最为明显。结论:一定剂量的五味子乙素对M146L细胞分泌的Aβ_(42)有明显的抑制作用。

地黄饮子脑脊液对M146L细胞活力及细胞凋亡的影响

目的:构建APP/PS1双基因转染细胞(M146L细胞)作为AD细胞模型,观察地黄饮子含药脑脊液对M146L细胞的细胞活力及细胞凋亡的影响,探讨其防治AD的作用机制。方法:将M146L细胞分为模型组、中低组、中中组和中高组,另设未经转染的CHO细胞为空白组,除空白组外,脑脊液处理细胞,LDH、MTT法检测各组细胞的细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:与空白组比较,模型组细胞培养液中LDH含量显著升高,有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,中药各剂量组细胞培养液中LDH含量均显著降低,中低组(P<0.05),中中组、中高组尤为显著(P<0.01)。与空白组比较,模型组OD值明显降低,有(P<0.01),与模型组比较,中药各剂量组OD值均显著升高,中低组(P<0.05),中中组、中高组尤为显著(P<0.01)。与空白组比较,模型组细胞凋亡率明显升高(P<0.01),M146L细胞可以模拟AD细胞凋亡的特征,与模型组比较地黄饮子脑脊液各组细胞凋亡率均明显降低(P<0.01或P<0.05),中高组和中中组优于中低组。结论:地黄饮子含药脑脊液可以明显减轻M146L细胞的受损程度,增加活细胞数量,提高细胞活力,抑制细胞凋亡,从而起到神经保护作用,防治AD。

补肾益智方有效部位群对M146L细胞分泌β淀粉样蛋白的抑制研究

目的探讨补肾益智方有效部位群对M146L细胞分泌的β淀粉样蛋白的影响,寻找潜在的具有抑制Aβ分泌的中药复方有效群。方法体外培养稳定转染人类阿尔茨海默病(AD)β淀粉样前体蛋白(beta-amyloid protein precursor,APP)基因及突变型早老素1(prsenilin-1,PS1)基因的中华仓鼠卵巢上皮细胞系(M146L),使之高效产生β淀粉样蛋白Aβ1-42,建立Aβ1-42过度表达的细胞模型。加入待筛选的补肾益智方有效提取部位群,用MTT法检测不同浓度的补肾益智方有效提取部位群(0,12.5,50μg/ml)对M146L细胞的毒性作用,应用Western blot免疫印迹方法分别检测突变型PS1M146L和野生型APP751双转染稳定表达CHO细胞系分泌的Aβ1-42的变化。结果不同浓度的补肾益智方有效部位群对M146L存活均无影响,不具有细胞毒作用。其中浓度为12.5μg/ml有效部位群F1和F2对M146L细胞分泌Aβ1-42有抑制作用。结论一定剂量的补肾益智方有效提取部位群对M146L细胞分泌的Aβ1-42有明显的抑制作用,其机制有待进一步研究。

二甲双胍通过增强M 146 L细胞IDE表达促进胞内Aβ降解

【目的】探讨二甲双胍(Met)作用AD细胞模型M146L的淀粉样蛋白-β(Aβ)病理改善作用及其潜在机制。【方法】MTT比色法检测不同浓度Met对细胞活力的影响;Western Blotting检测Met处理后Aβ_(42)、生成Aβ相关的淀粉样蛋白前体(APP)、β分泌酶(BACE),以及Aβ降解相关的胰岛素降解酶(IDE)、脑啡肽酶(NEP)、轻链蛋白3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)的表达量变化;免疫荧光检测Met处理后Aβ_(42)、IDE的表达;Western Blotting检测IDE的特异性抑制剂杆菌肽(Bac)和Met联合处理后IDE和Aβ_(42)的表达情况。【结果】Met处理可显著下调M146L细胞Aβ_(42)蛋白表达水平(P<0.05),但Met对M146L细胞内APP、BACE表达无显著影响(P>0.05)。另外,M146L细胞内IDE、NEP及LC3Ⅱ/Ⅰ水平显著低于正常对照组(中国仓鼠卵巢细胞,CHO细胞)(P<0.05)。当Met处理24 h后,IDE蛋白表达和免疫荧光检测均明显升高(P<0.05)。一旦Met和IDE的特异性抑制剂Bac联合处理M146L细胞24 h,观察到IDE表达下降(P<0.05),而细胞内Aβ_(42)水平则明显升高(P<0.05)。【结论】本研究明确了Met对M146L细胞Aβ_(42)异常积累的改善作用,并且初步阐明其潜在机制是通过促进Aβ降解途径中IDE表达增加介导的,为T2DM药物二甲双胍作为AD潜在治疗药物提供实验基础。

钨酸锂抑制β-淀粉样蛋白分泌及神经元的保护作用研究

目的研究钨酸锂对人淀粉样前体蛋白及早老素-1(M146L)细胞分泌β-淀粉样蛋白(Aβ1-42)的影响及其对体外培养新生小鼠大脑皮层神经元的保护作用。方法①体外培养转染AD相关基因、可分泌Aβ1-42的M146L细胞,在培养液中加入低、中、高剂量(3.1、5、8mmol/L)钨酸锂或阳性对照药,通过对M146L细胞活性及培养基中Aβ1-42含量的测定,研究钨酸锂对M146L细胞分泌Aβ1-42的影响。②体外无血清培养新生小鼠大脑皮层神经元,采用NSE免疫细胞化学染色法进行神经元鉴定;观察神经元突起生长状况,分析研究钨酸锂对大脑皮层神经元的神经保护作用。结果①低、中、高剂量钨酸锂对M146L均无细胞毒性;②低、中、高剂量钨酸锂可抑制M146L细胞分泌Aβ1-42;③原代培养的新生小鼠大脑皮层神经元,经NSE免疫细胞化学染色被染成棕褐色的细胞占绝大多数,表明所培养细胞基本为神经元;④除低浓度(0.008mmol/L)外,终浓度分别为0.2,0.04mmol/L的钨酸锂均能明显使突起数目和长度增加,可促进神经元的存活。结论适量的钨酸锂可抑制M146L细胞分泌Aβ1-42;对新生小鼠大脑皮层神经元具有神经保护作用。