荧光假单胞菌M18 rpoD克隆及其对抗生素合成的影响

荧光假单胞菌M1 8对多种植物病原真菌具有显著的抑制作用。荧光假单胞菌(Pseuclomonesfluo rescens)M1 8能同时合成吩嗪 1 羧酸 (PCA)和藤黄绿菌素 (Plt)两种抗生素。从M1 8的基因组中克隆了rpoD基因 ,其相应的氨基酸序列与荧光假单胞菌CHAO中RpoD蛋白的氨基酸序列完全相同。利用基因重组技术和大肠杆菌 荧光假单胞菌穿梭质粒pME60 32 ,将rpoD置于强启动子Ptac的控制下 ,导入M1 8菌株。发现经重组质粒转化的M1 8,与对照相比 ,培养基中PCA和Plt开始累积的时间分别提前 4h和 8h ,积累量提高 1倍和 6倍。

筛选假单胞菌株 M18 防治大棚黄瓜枯萎病害

设计了一种新的高效筛选程序，从植物根际土壤中分离出一株具有ＡＣＣ脱氨酶活性的促生拮抗双功能假单胞菌株Ｍ１８．在培养皿中，Ｍ１８能有效地抑制黄瓜枯萎病菌以及多种其他枯萎病原菌和植物病原菌的生长．Ｍ１８活菌浸种处理春黄瓜种子以及在大棚定植后根际土壤浇灌的试验中，与对照组相比，黄瓜枯萎病的株发病率降低７０％～８０％，霜霉病的发病率和病情指数都同时平均下降７０％左右，黄瓜产量提高２０％以上，每公顷可增加产值０．９万元以上，Ｍ１８的生物防治效果达到极显著程度．

藤黄绿脓菌素的自诱导及假单胞菌M18抗生物质代谢相关性初步分析

假单胞菌M18的生防功能归功于其分泌吩嗪-1-羧酸和藤黄绿脓菌素。为了研究抗生物质合成代谢相关性及调控机制,分别构建了两种抗生物质合成基因簇插入突变株M18T和M18Z1。用翻译融合表达载体pMEAZ(pltA′-′lacZ)分别转化野生株和突变株M18T、发酵培养并测定β-半乳糖苷酶活性,结果显示,添加藤黄绿脓菌素使突变株M18T(pMEAZ)的β-半乳糖苷酶活性比野生株M18(pMEAZ)增加约6倍,表明藤黄绿脓菌素对自身基因簇具正向自诱导作用。抗生物质的测定结果显示,突变株M18T无藤黄绿脓菌素合成,而吩嗪-1-羧酸的合成量与野生株相同;突变株M18Z1与野生株相比,吩嗪-1-羧酸明显减少,藤黄绿脓菌素却显著提高。过量的吩嗪-1-羧酸又抑制藤黄绿脓菌素的合成。表明,假单胞菌M18中独有的代谢相关方式为:藤黄绿脓菌素不影响吩嗪-1-羧酸,但吩嗪-1-羧酸负调控藤黄绿脓菌素。

假单胞菌株M18分泌羧基吩嗪抑制黄瓜枯萎病害

设计并应用新的高效筛选程序 ,从植物根际土壤分离出同时具有促进植物生长和抑制黄瓜枯萎病害的假单胞菌株 M1 8.它对黄瓜幼苗的根系具有明显的促进作用 ,在培养皿中 ,M1 8能有效地抑制黄瓜枯萎病菌以及多种其他植物病原菌菌丝体的生长 .经 M1 8活菌浸种处理春黄瓜种子并在大棚内浇灌定植后的根际土壤 ,与对照相比 ,黄瓜枯萎病的株发病率降低 70 %～ 80 % ,霜霉病的发病率和病情指数都同时平均下降 70 %左右 ,黄瓜产量提高 2 0 %以上 .M1 8的生物防治效果达到极显著程度 .对培养液中纯化的抗真菌物质进行光谱分析和 LC- MC测定的结果表明 ,M1

荧光假单胞菌M18的rpoS基因克隆及其功能分析

从荧光假单胞菌 (Pseudomonasfluorescentsp .)M1 8基因组中克隆了RNA聚合酶的稳定期σs 因子编码基因rpoS ,推测其氨基酸序列与铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌的同源性分别为 99 1 %、87 35 %和87 8%。利用体外定点插入突变和同源重组技术 ,构建了M1 8的rpoS突变株M1 8R- 。对突变株M1 8R- 合成抗生素吩嗪 1 羧酸 (PCA)和藤黄绿菌素 (Plt)的动力学分析结果表明 ,在KB或PPM培养基中 ,突变株合成PCA的能力比野生型分别提高了 2 5或 5 78倍 ,但Plt的积累量不受影响。与野生型相比 ,突变株对碳源饥饿的耐性下降。同时 ,在碳源饥饿条件下对过氧化氢、乙醇和和氯化钠等环境胁迫的交叉保护性减小 。

假单胞菌M18rsmA^-突变株的构建及其对Plt和PCA合成的区别性调控作用

假单胞菌 (Pseudomonassp .)M18是促进植物生长的根际细菌 ,能产生吩嗪 1 羧酸 (PCA)和藤黄绿菌素 (Plt)两种不同的抗生素抑制植物病原菌 ,保护植物免受病害。运用PCR方法 ,从M18基因组中 ,扩增出rsmA基因部分片段 ,并以该片段为探针 ,从M18的基因组柯斯文库中筛出阳性克隆 ,切取带有rsmA基因及两侧序列的 1 5kb片段 ,中间插入编码Kmr 的DNA片段 ,获得rsmA- 体外突变体。运用同源重组剔除技术 ,构建了M18菌株的rsmA突变株M18R- 。突变株M18R- 生物合成Plt的能力比野生型M18提高 4倍 ,但是 ,PCA产量仅为野生型的 2 0 %。研究结果表明 ,全局性调控基因rsmA可能通过不同的机制区别性地影响Plt和PCA的生物合成。

荧光假单胞菌株M18防治甜瓜蔓枯病害

荧光假单胞菌株 M1 8在离体条件下 ,能有效抑制甜瓜蔓枯病菌的菌丝生长 .经甜瓜蔓枯病菌的苗期接种试验 ,M1 8的菌悬液 (1 0 8CFU/m L )对甜瓜蔓枯病的防治效果达到 80 %左右 .在苗期接种抗性诱导试验中 ,发现荧光假单胞菌株 M1 8还具有诱导甜瓜幼苗产生系统性抗甜瓜蔓枯病菌感染的能力 .从 M1 8培养液中 ,提取并纯化了抗生物质吩嗪 - 1 -羧酸 (PCA) ,该物质对甜瓜蔓枯病菌具有强力抑菌作用 ,EC50 值仅为 3.2 4 μg/m L.在大田试验中 ,M1 8可以保持 80 %的防治效果 ,显著提高甜瓜产量 ,并且还发现在蔓枯病发病初期 ,M1

荧光假单胞菌株M18产吩嗪-1-羧酸的条件

在摇瓶发酵条件下 ,研究了产吩嗪 - 1 -羧酸 ( PCA)的荧光假单胞菌 M1 8在各种碳源、氮源、盐类、温度、接种量下 PCA的分泌量 ,确定了适合 PCA分泌的最佳培养基 ( 1 L) :葡萄糖 2 0 g,肉胨2 2 g,KNO3 1 0 g;最佳培养条件 :温度 2 8°C,起始 p H 7.0 ,装瓶量 2 0 0 /5 0 0 ( m L) ,接种量 5 % ;最佳培养时间 72 h.在此条件下 ,PCA在发酵液中的浓度可达到 82 0 mg/L.

高效液相色谱法快速测定抗真菌制剂M18中的吩嗪-1-羧酸

建立了测定抗真菌制剂M18中吩嗪 1 羧酸的反相高效液相色谱方法。流动相为甲醇 5mmol/L磷酸缓冲液(pH 5 0 ) (体积比为 6 0∶40 ) ,流速为 1mL/min ,检测波长为 2 48nm ,线性范围是 5 0mg/L～ 5 0 0mg/L ,检测限是 30mg/L ,回收率为 97 5 3% ,RSD为 1 5 %。该方法具有快速、简便、灵敏。

假单胞菌M18调控因子GacA与RsmA的相关性及对抗生物质合成代谢调控机制的分析

假单胞菌M18是一株可同时合成并分泌吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylic acid,PCA)和藤黄绿脓菌素(Pyoluteorin,Plt)两种抗生物质的生防菌株。为了进一步研究假单胞菌M18抗生物质合成代谢的调控方式与机制,在分别构建gacAr、smA等单基因突变株基础上,又构建了gacArsmA双基因突变株M18GR以及gacA′-l′acZ和rsmA′-′lacZ等翻译融合表达载体(pMEGA和pMERA)。通过在PPM和KMB两种培养基中发酵培养和两种抗生物质PCA和Plt的HPLC定量测定显示,双突变株M18GR的PCA和Plt的合成量不论在PPM还是在KMB培养基中都介于单突变株M18G和M18R之间。由实验结果分析推测,两种调控因子对抗生物质合成的调控作用不是发生在转录水平,很可能发生在转录后水平。由β-半乳糖苷酶的定量分析表明,在假单胞菌M18中,两种调控因子不存在自诱导机制;虽然GacA未调控RsmA的合成,但RsmA可能部分正向调控GacA的表达。

荧光假单胞菌株M18产PCA发酵条件研究

在摇瓶发酵条件下 ,研究了产吩嗪 1 羧酸 (phenazine 1 carboxylicacid ,PCA)的荧光假单胞菌M 18在各种碳源、氮源、盐类、温度、接种量下PCA的积累情况 ,确定了适合PCA分泌的最佳培养基 (1L)为 :葡萄糖 2 0 g ,肉胨 2 2 g ,KNO310 g ,NaCl 0 g ;最佳培养温度为 2 9℃、接种量为5 % ;最佳培养时间为 4 4h左右。在此条件下 ,PCA在发酵液中的浓度可达到 75 0mg/L 。

假单胞菌M18株pltZ基因转录阻抑藤黄绿菌素ABC转运系统

假单胞菌(Pseudomonassp .)M18株的藤黄绿菌素(Pyoluteorin ,Plt )生物合成基因簇下游存在一个Plt生物合成负调控基因pltZ和一个负责Plt分泌及自身抗性的ABC(ATP_bindingcassette)转运系统基因簇。利用启动子探针载体pME6 0 15和pME6 5 2 2分别构建ABC转运基因pltH与lacZ的翻译和转录融合表达质粒pHZLF和pHZCF ,分别引入野生型假单胞菌M18株和pltZ突变菌株M18Z。半乳糖苷酶活性的测定结果表明:在pltZ突变株M18Z中,pltH’-‘lacZ翻译融合表达水平约比野生型提高3 7～8 4倍,pltH’‘lacZ转录融合表达水平显著提高了2 8～7 4倍,表明pltZ能在转录水平上阻抑PltABC转运系统的表达,pltZ很可能通过阻抑PltABC转运系统的表达。

M18甲醇汽油燃料技术研究

在汽油机燃料的替代技术中,M18甲醇汽油技术以其节能、环保、廉价等性质,愈来愈被科研人员和广大用户所重视。本文介绍了M18甲醇汽油的研制、试验情况。

假单胞菌M18转录调节因子σ^S基因与无启动子lacZ基因融合突变株的构建和鉴定

通过菌落原位杂交和Southern杂交,从假单胞菌M18基因组文库中克隆了rpoS基因及相邻序列。为了深入研究影响rpoS基因表达的调控因素,运用同源重组技术,将无启动子β-半乳糖苷酶基因(-′lacZ)插入并融合于rpoS基因中,构建了假单胞菌M18rpoS基因突变株M18SZ。Miller法测定显示,突变株M18SZ的β-半乳糖苷酶可高达480U,而野生株检测不到β-半乳糖苷酶活性。表明,突变株中的rpoS基因与无启动子β-半乳糖苷酶基因已融合并且表达。在KMB培养基中生长量测定(OD600)的结果表明,突变株与野生株生长存在显著差异。

假单胞菌株M18gacA基因对BHL和HHL合成正调控及对PCA合成负调控无相关性

经初步鉴定,假单胞菌株(Pseudomonassp.)M18至少能产生5种N-酰基高丝氨酸内酯类(N-acyl-homoserinelactones,AHLs)信号分子,它们是:N-丁酰高丝氨酸内酯(N-butyryl-L-homoserine lactone,C4-HSL,BHL)、N-己酰高丝氨酸内酯(N-hexanoyl-L-homoserine lactone,C6-HSL,HHL)、N-3-氧-己酰高丝氨酸内酯[N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserinelactone,3-Oxo-C6-HSL,OHHL]、N-3-氧-辛酰高丝氨酸内酯[N-(3-oxooctanoyl)-L-homoserine lactone,3-Oxo-C8-HSL,OOHL]和N-3-氧-癸酰高丝氨酸内酯[N-(3-oxodecanoyl)-L-homoserine lactone,3-Oxo-C10-HSL,ODHL)。在gacA突变菌株M18G中,信号分子的积累量明显减少,且只能检测出其中的4种;同时,吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylic acid,PCA)的合成量比野生株M18提高了2倍左右。在M18菌株中,基因rhlⅠ的编码产物参与BHL和HHL的合成。构建rhlI’-’lacZ翻译融合表达质粒pMEIZ,分别导入野生株M18和突变株M18G,突变株M18G的半乳糖苷酶活性比野生株M18下降约40%,表明GacA对基因rhlI的表达具有正调控作用。但是,在野生株M18和突变株M18G的发酵液中,分别或同时添加过量的外源BHL和HHL,对PCA合成的影响不显著,表明在突变株M18G中,PCA合成量的增加与BHL和HHL合成量的减少没有明显的相关性。

产PCA基因工程菌M18G反复补料分批培养研究

吩嗪-1-羧酸(PCA)是一种广谱、高效的微生物源农药,采用反复补料分批培养工艺可提高PCA合成速率,为实现PCA的商业化生产打下了良好的基础。本试验针对高产PCA的基因工程菌M18G,首先在摇瓶培养条件下,用正交试验法研究了培养基中各主要营养因子葡萄糖、黄豆粉、甘油、95%乙醇等对PCA产量的影响,并确定了适合PCA分泌的最佳培养基(1L)为:葡萄糖6g,黄豆粉40g,甘油6mL,95%乙醇5.9mL;然后确定了反复补料分批培养时更换新鲜培养基的最佳时间为每次培养进行48h后、体积比例为90%。在此条件下,培养进行五个周期后,PCA的合成速率可达到2.27mg/h,是优化后分批培养的1.34倍,同时延长了培养周期,有利于提高设备使用率,降低生产成本。

假单胞菌M18调控基因ppbR的克隆及功能研究

假单胞菌(Pseudomonas sp.)M18是促进植物生长的根际细菌,能产生吩嗪-1-羧酸(PCA)和藤黄绿菌素(Plt)两种不同的抗生素。根据生物信息学分析,铜绿假单胞菌PA2572基因编码蛋白可能是一个双元调控系统的应答调节子。本研究从假单胞菌M18基因组中扩增出PA2572同源基因片段ppbR,利用体外定点插入突变和同源重组技术构建了M18的ppbR突变株M18P。研究结果表明,突变株M18P在泳动能力和群集运动能力上有显著的下降。突变株合成PCA的能力比野生型有显著的下降,在发酵液中PCA积累量仅为野生型的50%。在KMB培养基中,突变株Plt的积累量和野生型没有显著的差异。

诱变筛选荧光假单胞菌M18高产吩嗪-1-羧酸(PCA)菌株及发酵条件研究

研究了亚硝基胍 (NTG)的诱变剂量、处理时间以及氯化钠浓度对野生型荧光假单胞菌M 18存活率的影响 ,NTG的诱变剂量 2 5～ 2 0 0mg/L ,处理时间 10～ 30min范围内 ,随着诱变剂剂量增加和时间的延长 ,M 18的存活率不断下降。NTG的作用剂量 2 5mg/L ,处理时间 10min时 ,细菌存活率为 5 5 %左右。利用细菌存活率为 5 5 %时的诱变条件 ,经生物测定 ,初筛获得 2 0株抑菌效果明显的诱变株。经摇瓶发酵复筛 ,从这 2 0株诱变株中 ,获得PCA高产诱变株M 18N0 7。并对此菌株发酵条件进行调整 ,较理想的培养条件为 :蛋白胨 18g/L ,葡萄糖 16 g/L ,氯化钠 1g/L ,硝酸钾10 g/L。小瓶培养时间 17h ,大瓶 5 %接种量 ,2 8℃培养 5 4h。

成熟的魅力 熊猫M18试用手记

熊猫手机由于各种问题曾经有一段时间从我们的视线中消失了,到了2003年易美系列的推出则慢慢让熊猫走出了低谷,而后推出的全新GM系列更是让广大消费者重新接受了熊猫手机。重新占领了手机滩头阵地后,熊猫则加足了马力全面挺进,M18则是这支主力部队的先锋人物之一,极具男人味的简约造型以及丰富功能配置给市场带来了不小的冲击。