表达禽流感病毒M2基因的重组马立克氏病病毒的构建

将禽流感病毒M2基因克隆于真核表达质粒pIRES-EGFP中,使其位于pCMV启动子的调控下,并与绿色荧光蛋白基因(EGFP)串联后,将上述串联基因插入到含MDV CVI988的非必需区US基因的重组质粒pUS2中,构建带标记的重组质粒,然后将此重组质粒转染感染了MDVCVI988的鸡胚成纤维细胞,利用同源重组的方法,筛选了表达禽流感病毒M2基因的重组病毒MDV1。经PCR、dot blotting,Western blotting等实验的结果表明,禽流感病毒M2基因的确插入到MDV1(CVI988)基因组中并获得表达。重组MDV1免疫1日龄SPF鸡21天后,用ELISA可检测到M2蛋白的特异性抗体。接种了重组病毒rMDV的鸡体内针对H9N2疫苗血凝素的抗体滴度(p<0.05)明显提高,以禽流感病毒AIVA/Chicken/Guangdong/00(H9N2)攻毒后进行病毒重分离试验的结果发现,重组病毒能有效地降低病毒的排出量(p<0.01),说明该重组病毒可以用于防制禽流感的免疫。

靶向呼吸道合胞病毒M2基因pshRNA载体质粒的构建及意义

目的:构建针对呼吸道合胞病毒(RSV)M2基因m RNA的短发卡结构状RNA(shRNA)重组载体质粒,为利用RNA干扰技术抗RSV感染的深入研究奠定基础;方法:按shRNA设计原则,选择RSV-M 2基因作为靶基因,设计19bp长的能产生短发卡结构的两段DNA反向重复序列,中间以9bp序列间隔,经退火形成互补双链,克隆至转录载体pgenesil-1上,重组质粒经酶切和测序鉴定,然后将构建成功的重组质粒转染H EP2细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光细胞发生率以评估转染效率。结果:将设计合成的DNA片段成功克隆至载体上,经酶切及序列鉴定为目的序列,并且荧光显微镜下观察细胞有较多的绿色荧光蛋白表达。结论:成功构建了针对RSV M 2基因m RNA的shRNA重组载体质粒,可利用重组质粒进一步研究其对RSV感染的抑制,从而为抑制RSV感染寻找新的基因治疗手段。

甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及序列分析

目的构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体并分析插入的M2基因序列。方法从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增M2基因。通过分子克隆技术将所扩增片段克隆入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)。经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的M2基因序列进行分析。结果经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功。序列分析有4个氨基酸出现变异,提交Genbank进行Blast比对显示同源性97%(Genbank/NCBI AY768951)。结论M2四聚体蛋白具有H+通道功能,能够协助病毒与宿主细胞膜融合后释放RNP复合体,还能稳定HA蛋白的结构。M2蛋白的高度保守性和具有交叉保护能力特性使之成为新型的通用流感疫苗的突破口。该结果将为甲型流感病毒基因工程疫苗,通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。

甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及初步表达

目的:构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体。体外转染真核细胞株HEK293细胞并检测目的蛋白的表达。方法:从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增M2基因。通过分子克隆技术将所扩增片段插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)。经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到HEK293细胞中,通过免疫荧光技术鉴定其表达。结果:经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功。免疫荧光技术证实流感病毒M2基因的表达。结论:甲型流感病毒M2蛋白是一种具有高保守性,可形成离子通道并影响流感病毒表面蛋白血凝素(HA)天然构象的形成,被认为是具有交叉免疫保护性的结构蛋白。甲型流感病毒M2基因真核表达质粒的构建及成功表达将为甲型流感病毒基因工程疫苗,通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。

STXBP1基因和CNNM2基因突变导致儿童大田原综合征伴低镁血症1例并文献复习

患儿,男,2个月,因“反复抽搐1个月余”就诊于深圳市儿童医院。抽搐表现为上肢前臂前举内收抖动,双眼上翻或凝视,四肢强直、抖动,持续数秒后可自行缓解,抽搐后精神反应可,间断惊厥发作,每天3~4次,无嘴角歪斜,无口吐白沫,面部及口唇无发绀、苍白,无发热、咳嗽,无呕吐、腹泻,无大小便失禁等不适。查体:神清,精神反应可,全身皮肤红润、弹性可,未见皮疹及出血点.

基于TCGA数据库的肺腺癌G2/M检查点基因预后模型的建立与应用

目的基于癌症基因组图谱(TCGA)数据库建立肺腺癌(LUAD)的G2/M检查点相关基因风险预后模型。方法通过TCGA数据库获取并整合了LUAD基因表达数据及临床数据,根据Reactome定义的G2/M检查点相关基因集筛选出影响预后的G2/M检查点相关基因,通过单因素和多因素COX分析建立风险预后模型,对模型高、低风险组进行生物学标志基因集和KEGG通路富集的差异分析并进行免疫相关性分析。结果预后模型由7个基因组成,该模型生存预测性能的AUC值为0.726。高风险组的总体生存率明显低于低风险组(P<0.05)。细胞增殖的相关通路在高风险组中富集。风险评分的增高与多种免疫细胞的浸润比例存在一定相关性(P<0.05)。结论由7个基因组成的风险预测模型可作为独立预测因子来有效预测LUAD的预后。

H5N1亚型禽流感病毒缺失跨膜区M2基因的原核表达及其单克隆抗体的制备

为制备针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)M2蛋白的单克隆抗体,将H5N1亚型AIV缺失跨膜区的M2基因(sM2)克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,通过IPTG诱导表达,获得可溶性的36ku sM2融合蛋白。以100μg纯化的sM2融合蛋白免疫8周龄BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。以sM2融合蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法检测,将M2融合蛋白抗原检测阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆筛选,获得4株单克隆抗体,分别被命名为1A9、2D4、3E6和4E7,亚类分别为IgG2b、IgG1、IgG2a、IgG2a。间接免疫荧光试验显示,单克隆抗体与不同clade的H5亚型AIV感染的MDCK细胞均产生特异性荧光反应,可用于H5亚型AIV的检测。

TREM2基因与晚发型阿尔茨海默病

APOE基因作为晚发型阿尔茨海默病（late-onset AD,LOAD）最主要的致病基因得到广泛的研究.同时,近年来研究发现,编码2型髓样细胞触发受体基因（TREM2）R47H位点突变也与晚发型阿茨海默病有重大关联.研究认为TREM2基因具有抑制中枢炎症及介导加强中枢单核细胞吞噬系统对Aβ、凋亡细胞碎片等吞噬功能.然而目前对其确切的作用机制却不甚明了,而其R47H位点突变与LOAD发病的发病机制也有待研究证实.本文就TREM2基因与中枢炎症及介导Aβ吞噬作用作一综述.

人β_2m基因的克隆及表达

目的 克隆和表达HLA I类分子轻链(β2m)基因,为人工制备HLA I类分子提供基础。方法 利用逆转录PCR技术从Jeg-3细胞株中克隆β2m基因,与质粒pET22b(+)重组,构建原核表达载体pET22b(+)-β2m,转化宿主菌E.coli BL21(DE3),诱导β2m基因高效表达,并采用双抗体夹心ELISA法对表达产物进行抗原性和功能鉴定。结果 酶切和测序证实β2m基因克隆和载体构建成功,目的蛋白在宿主菌中高效表达于包涵体中;通过包涵体的分离和纯化获得初步纯化的β2m,所制备的β2m能够与特异性抗体结合,并能与HLA I类分子重链形成具有天然构象的HLA I类分子。结论 人β2m基因能够在原核宿主中高效表达,表达产物具有形成HLA I类分子的功能。

禽流感病毒M2e基因与鸡IgG Fc基因在巴斯德毕赤酵母中的融合表达

【目的】得到融合蛋白M2e-Fc,并检测其免疫学特性,为研制禽流感通用疫苗奠定基础。【方法】根据禽流感病毒H5N1的M2e蛋白氨基酸序列设计2条长互补引物,通过重叠区互补扩增基因法扩增出目的基因M2e,然后与鸡IgGFc片段基因一起克隆入毕赤酵母表达质粒中,构建酵母表达载体。将阳性质粒线性化后电转化入感受态毕赤酵母X-33中,再经甲醇诱导后,通过Tricine-SDS-PAGE电泳及Western-blotting鉴定融合蛋白。之后用其免疫非免疫鸡,检验其免疫原性。【结果】成功构建了表达M2e和Fc融合蛋白的酵母表达载体pPICZαA-M2-Fc,并通过Zeocin筛选及PCR鉴定出了阳性重组子;阳性重组子经甲醇诱导后得到融合蛋白,Tricine-SDS-PAGE电泳及Western-blotting鉴定证实,融合蛋白得到正确表达,并且可以与M2e阳性血清反应。动物免疫试验证实,该融合蛋白可以诱导鸡产生抗M2e抗体,具有良好的免疫原性。【结论】融合蛋白M2e-Fc在巴斯德毕赤酵母表达系统中得到了成功表达,该融合蛋白具有较好的免疫原性,为后期进行其他免疫试验奠定了基础。

人β_2m转基因小鼠的制备、筛选及鉴定

目的 :制备人β2 m转基因小鼠 ,研究HLA B2 70 4的表达。方法 :应用显微注射将人 β2 m基因注入C5 7BL/6×昆明鼠和昆明鼠×昆明鼠F1代受精卵 ,出生动物及其后代经PCR筛选 ,采用斑点杂交和Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定和测定整合拷贝数 ,利用RT PCR检测阳性鼠中人 β2 m转基因的表达。结果 :6只原代仔鼠及 7只它们的下一代 (F1)带有人 β2 m基因。由微注射基因后移卵出生的 86只小鼠中 ,C5 7BL/6×昆明鼠杂交仔鼠 35只 ,其中 4只阳性 (11.4% ) ,昆明鼠×昆明鼠杂交仔鼠 5 1只 ,其中 2只阳性 (3.9% ) ,含有人 β2 m基因的原代鼠×昆明鼠杂交仔鼠 2 0只 ,其中 7只阳性。整合的转基因均为单拷贝。Southern杂交证实上述阳性鼠确有转基因整合。阳性鼠的皮肤、结肠、睾丸和脾脏组织中均有人 β2 m转基因mRNA的表达。结论 :在转基因动物制备中 ,C5 7BL/6×昆明鼠F1代明显优于昆明鼠×昆明鼠F1代。与人HLA B2 70 4基因相比 ,人 β2 m基因不易整合 ,其整合率与整合拷贝数均较低。得到的人 β2 m转基因小鼠能够将人 β2 m基因传给下一代并可与人HLA B2 70 4转基因鼠交配。

cry2Aa9m抗虫基因植物表达载体构建及对大豆的遗传转化

cry2Aa9m基因编码的杀虫晶体蛋白(ICPs)对鳞翅目(Lepidoptera)和双翅目(Dipter)昆虫具有显著的毒杀作用,可防治大豆食心虫等害虫。试验构建了由豆荚特异性启动子Pmsg调控的cry2Aa9m基因的植物表达载体pCMB2A,以抗除草剂bar基因为筛选标记,通过农杆菌介导法对绥农28大豆子叶节进行遗传转化,获得抗性株系8株。经PCR和RT-PCR检测结果证明,cry2Aa9m基因已经整合到大豆基因组中并得以表达。研究为抗大豆食心虫转基因育种产业化奠定基础。

鸡MHCⅠα和β2m链基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

为进一步研究主要组织相容性复合体Ⅰ类(major histocompatibility complex,MHCⅠ)分子在免疫应答中的作用机制,试验经PCR克隆获得MHCⅠα和β_2m链基因,随后插入带有荧光标签蛋白的真核表达载体,成功构建了重组质粒pEGFP-MHCⅠα和pmCherry-MHCⅠβ_2m,并通过脂质体法转染293T真核表达细胞。荧光显微镜观察可见,MHCⅠα和β_2m分子主要分布于真核细胞的内膜系统,改变了与之融合的荧光蛋白在细胞内的定位。此外,Western blotting检测可见大小约68.3和41.3ku的目的蛋白反应带,表明重组质粒能够在293T细胞中顺利表达,且表达蛋白与鸡MHCⅠ类分子的相应抗体可发生特异性结合反应,具有良好的免疫学活性。

乌骨鸡和珍珠鸡BF2与β微球蛋白(β2m)基因克隆及品种多态性分析

克隆了乌骨鸡(BF2*SI)和珍珠鸡(BF2*NM)群主要组织相容性复合体I(MHC class I)和β微球蛋白(β2m)基因,分析了其分子特征与等位基因多态性。BF2*SI相互间氨基酸同源率为75.5%~93.9%,保留了人HLA-A2与抗原多肽结合的7个关键性氨基酸。BF2*NM相互间氨基酸同源率为81.1%~98.5%,保留了人HLA-A2与抗原多肽结合的6个关键性氨基酸。BF2*SI在α1和α2区(抗原多肽结合区,PBD)有24个高置换率位点,置换率最高的为69位和9位。BF2*NM在PBD区共有6个高置换率位点。BF2*SIPBD发生氨基酸置换的位点数大于来航鸡BF2,BF2*NMPBD区氨基酸置换的位点数和置换率则远远小于来航鸡BF2。根据同源率,将BF2*SIα1区分为4类,α2区分为3类,α3区分为3类,并由此聚类为5个系谱(A^E)。将BF2*NMα1区分为3类,α2区分为3类,α3区分为1类,并由此聚类为3个系谱(A^C)。比较发现BF2*03SI、BF2*04SI和BF2*05NM的α1区与抗马立克氏病的BF2*21同源率最高(分别为86.4%、86.4%和87.5%);BF2*05SI和BF2*05NM的α2区与BF2*21同源率最高(均为93.4%)。另外,根据成熟肽区的氨基酸序列可将乌骨、珍珠鸡β2m分为两类,第一类和来航鸡β2m(M84767)氨基酸序列完全相同,第二类与第一类相比,氨基酸序列相互间同源率为85.7%。结果揭示了各类鸡的MHCⅠ和β2m基因具有品种分子特征。

呼吸道合胞病毒M_(2-1)基因表达对人肺腺癌PAa细胞生长的影响

探讨呼吸道合胞病毒(RSV)M2 -1基因在人肺腺癌PAa细胞的表达及对其生长的影响。重组真核质粒PXJ 4 1/M2 -1转染肺腺癌PAa细胞 ,应用RT PCR、Westernblot方法检测表达。通过MTT生长曲线、流式细胞光度术、细胞贴壁能力、集落形成、接种裸鼠等 ,观察PAa细胞体内外生长变化。结果显示 :①转染阳性重组子经双酶切及RT PCR扩增均可见目的区带 ;②Westernblot检测可见特异性条带 ;③PAa/M2 -1细胞S期下降 ,G2 /M期增加 ;贴壁能力下降 ,集落形成率增高 ,集落细胞数增多 ;④PAa/M2 -1细胞成瘤时间晚 ,但生长速度快 ,瘤组织由腺癌向鳞癌分化。提示M2 -1基因可能促进PAa细胞生长 。

新疆维、汉两民族阿尔茨海默病A2M基因多态性分析

目的研究新疆维、汉两民族阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)患者的α2-巨球蛋白基因(α2-macroglobulin,A2M)多态性,探讨该基因在维、汉不同族别中基因型及等位基因频率的差异。方法在对新疆维、汉两民族≥50岁常住居民共计8284人所进行的AD流行病学调查基础上,随机抽取209例散发AD患者,平均年龄(74.2±12.6)岁,其中维吾尔族111例,汉族98例;匹配的正常对照220名,平均年龄(73.8±13.1)岁,其中维吾尔族117名,汉族103名,进行病例对照研究。用PCR-RFLP技术分析A2M基因I1000V多态性。结果AD患者等位基因A2M-I1000V的频率为8.61%,高于对照组的3.64%(P<0.05)。汉族人群A2M的I/I基因型及等位基因I频率高于维族(P<0.05),而维族人群中I/V基因型及等位基因V的频率高于汉族(P<0.05)。不伴有ApoEε4的AD组与对照组间,A2M基因中I/V基因型分布AD组高于对照组(P<0.05)。结论新疆维、汉两民族AD患者与A2MI1000V多态性有关,且A2M基因型及等位基因频率分布表现出明显的族别、性别的差异性,A2M可能独立于ApoEε4而对AD的发生起一定作用。

小鼠β_2m基因打靶载体的构建及序列分析

目的 采用分子生物学技术 ,构建小鼠 β2 m基因打靶载体 ,为下一步进行胚胎干细胞基因敲除、建立β2 m基因缺陷型干细胞奠定基础。方法 通过设计和合成引物 ,经PCR从小鼠 β2 m pSV2ΔHXgpt基因组克隆分别扩增小鼠 β2 m的 4 2kb和 0 8kb片段作为同源臂 ,将其分别插入载体pPNT的neo基因两侧 ,构建小鼠 β2 m基因替换型打靶载体pPNT β2 m。结果 经过PCR、限制性酶酶切鉴定 ,以及DNA序列分析 ,证实此两条同源臂为包含小鼠 β2 m前三个外显子在内的基因片段 ,证明载体构建成功。结论 PCR法构建基因打靶载体是新颖。

H9N2亚型禽流感病毒NA和M2基因的克隆与表达

旨在分别构建NA蛋白和M2蛋白的重组质粒,并进行表达鉴定。采用PCR扩增了H9N2分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017毒株的NA基因和M2基因。同源性分析证实,这2个基因序列与目前流行毒株的基因同源性很高。将NA基因克隆至pcold1原核表达载体,将M2基因克隆至pET28a原核表达载体,成功构建了pcold1-NA和pET28a-M2重组质粒,并成功表达出相应的融合蛋白。然后对表达的融合蛋白进行纯化,并采用免疫印迹验证其免疫反应性。本试验为进一步研究H9N2亚型禽流感病毒致病机制及检测技术奠定了基础。

新的β_2m基因打靶载体构建方法的建立

目的 :采用常规方法 (同源片段的插入方向与Neo基因相同 )构建载体的同时 ,将两条同源臂反向插入Neo基因的两侧 ,构建新型小鼠 β2 m基因替换型打靶载体 β2 m -pPNT ,即增加 3’同源臂的长度 ,探讨同源臂插入位置和长度变化对同源重组率的影响。方法 :设计和合成引物 ,经PCR从小鼠 β2 m -pSV2△HXgpt基因组克隆分别扩增出长度为 0 8kb和 4 2kb的 β2 m基因片段 ,作为 5’和 3’同源臂 ,分别反向插入载体pPNT的Neo基因上游和下游 ,构建小鼠 β2 m基因替换型打靶载体 β2 m -pPNT。结果 :经过PCR、限制性内切酶及DNA序列测定 ,证实此两条同源臂包含小鼠 β2 m的起始区和表达区 ,表明载体构建成功。结论 :PCR技术是构建基因打靶载体的简单而可靠方法。增加 3’同源臂的长度对研究提高胚胎干细胞基因敲除的同源重组率提供新的途径。