H9N2亚型禽流感病毒M2e蛋白在原核系统中的表达

以含有全长H9N2亚型AIV M2基因的质粒为模板,经PCR扩增得到M2e基因;利用BglⅡ和BamHⅠ之间互为同尾酶关系,构建顺次连接的多拷贝体M2e,并连接入原核表达载体pGEX-6p-1,构成2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组质粒,并转化至表达宿主菌中;将测序正确的菌液经不同浓度IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白大小,对蛋白进行可溶性分析;利用Western blot分析5种重组蛋白的反应原性。结果显示,在37℃下,2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组蛋白分别经终浓度为0.25、0.25、0.5、0.25、0.75mmol/L的IPTG诱导4h时,表达量最高;2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组蛋白大小分别为31.7、37.2、42.7、48.2、53.9ku;对重组蛋白进行可溶性分析显示,5种重组蛋白均以包涵体形式存在;Western blot分析显示,2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2epGEX重组蛋白与鼠抗GST标签的单克隆抗体具有良好的特异性反应,为后期进一步获得高免疫原性蛋白和筛选具有通用免疫原性的重组蛋白奠定基础。

禽流感病毒M_(2e)基因与鸡IgG Fc基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化

将含禽流感病毒M2蛋白膜外区(M2e)且偶联了鸡IgG Fc片段的重组质粒pET32a(+)的大肠杆菌,用终浓度为0.5 mmol/LIPTG在37℃下诱导表达,获得了包涵体表达的目的蛋白。Western-blotting试验表明,M2e能与兔抗禽流感H5阳性血清发生反应,且在47kD处出现一条特异性条带,具有良好的免疫学活性.表达产物通过His-Ni2+柱亲和层析后,得到了较好的纯化效果。本实验为进一步研究M2蛋白的生物学活性、检测方法及通用疫苗的开发奠定了基础。

M2e与Qβ融合原核表达载体的构建与初步评价

目的构建流感病毒M2基因(M2e)与Qβ的重组原核表达载体,并对Qβ-M2e病毒颗粒子(VLPs)进行免疫学评价,为预防性疫苗的研制打下基础。方法通过分子生物学手段,将M2e同Qβ质粒载体连接构建重组原核表达载体,经酶切、测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21中,密度梯度离心回收并纯化其表达产物Qβ-M2e。动物免疫后通过免疫组化、流式细胞术检测生发中心(GC)B细胞的增殖情况。结果酶切、测序结果均与预期结果相符,电镜下观察到重组蛋白为颗粒性蛋白。免疫动物后,GC B细胞增殖明显。结论成功构建了Qβ-M2e原核表达载体,并对表达的Qβ-M2e病毒颗粒进行了初步细胞学评价。该载体可作为流感病毒VLP疫苗的候选载体疫苗,为深入研究通用流感疫苗提供了资料。

4种禽流感病毒M2e多肽的串联表达和小鼠口服免疫效果

为研制广谱性禽流感口服疫苗,将4种禽流感病毒特异的基质蛋白2胞外区(matrix protein 2ectodomain,M2e)多肽与黏膜免疫佐剂CTA1-DD串联,原核表达并纯化CTA1DD-AVI4M2e融合蛋白。以200μg融合蛋白CTA1DD-AVI4M2e口服免疫BALB/c小鼠,结果显示实验组肠液IgA抗体效价和血清IgG抗体效价比对照组显著升高,血清中特异性IgG抗体效价达约360倍。分割的3段肠样中:第1段浸出液IgA抗体效价约为360倍,第2段约为120倍,第3段约为9 720倍。结果表明,本研究制备的CTA1DDAVI4M2e具有显著口服免疫效果,为后续研究提供了基础。

流感病毒M2e与白喉毒素无毒突变体CRM197融合蛋白的抗原性和免疫原性分析

流感病毒严重威胁人类健康且流行株不断变化,传统疫苗对流感预防具有局限性。流感病毒M2蛋白胞外区(M2e)氨基酸序列高度保守,可诱导产生特异性抗体,是通用流感疫苗研究的主要靶标之一。白喉毒素突变体(CRM197)是一种理想的蛋白载体,可增强小分子抗原的免疫原性,商业化的肺炎球菌疫苗采用CRM197结合形式提高多糖分子的免疫原性。本实验通过重组蛋白融合的方式,将M2e与CRM197(aa 1~535)、CRM197-N190(aa 1~190)、CRM197-N389(aa 1~389)的C端或N端进行融合表达,并考察融合蛋白的反应活性以及免疫原性。融合蛋白中的M2e和CRM197均具有反应活性;超速离心分析和四聚体特异构象单抗反应均表明融合蛋白(CRM197-N190)-M2e及M2e-(CRM197-N190)主要以类似M2e天然构象的四聚体形式存在;融合蛋白可与多株流感M2e特异性单抗以及CRM197特异性单抗反应,M2e融合至CRM197N末端形成的重组蛋白的反应活性高于C端融合蛋白;相比融合GST,与CRM197-N190的融合显著增强了M2e蛋白的免疫原性,为流感通用疫苗研究提供了新思路。

流感病毒膜蛋白M2e应用研究进展

流行性感冒是一种传染性较高的急性呼吸道疾病，极大地威胁了人类健康。由于流感病毒易发生变异，致目前的防治措施不能及时有效地应对，使防治效果严重降低。流感病毒膜蛋白M2e（extra-cellulardomainoftheM2protein）高度保守，是流感病毒的通用性作用靶点，基于M2e的免疫预防措施可提供广谱的保护作用。M2e疫苗及M2e抗体已成功在动物模型中发挥抗流感作用，临床应用则报道较少，因而研究M2e对于流感病毒的防治具有重要意义。

H9N2亚型禽流感病毒M2e和HA2串联蛋白在原核系统中的表达

构建H9N2亚型禽流感病毒M2蛋白胞外区（M2e）和HA蛋白颈部区（HA2）串联体，并在原核系统中进行该重组蛋白的表达，以便研究重组蛋白的反应原性。以含有全长H9N2亚型AIVHA基因的质粒为模板，经过PCR扩增得到HA2基因；利用BglⅡ和BamHⅠ互为同尾酶的链接方法，构建3个拷贝M2e和HA2基因的串联体，并将串联体连接入原核表达载体pGEX-4T-1构成3M2e＋HA2-pGEX重组质粒；同时构建单独表达HA2蛋白的原核表达重组质粒HA2-pGEX；DNA测序鉴定这两种重组质粒正确后，转化至表达宿主菌中；重组蛋白经不同IPTG浓度进行诱导；SDS—PAGE电泳鉴定重组蛋白大小，并进行可溶性分析和纯化；采用Western blotting法对两种重组蛋白的反应原性进行分析。结果显示，3M2e＋HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白分别经终浓度为0．5mmol／L和0．25mmol／L的IPTG诱导，37℃培养4h时，表达量最高；3M2e＋HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白大小分别为59．4ku和49．8ku；对重组蛋白进行可溶性分析显示，两种重组蛋白均以包涵体形式存在；Western blotting分析显示，3M2e＋HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白与免疫H9N2禽流感病毒后获得的阳性血清具有良好的特异性反应，这些结果为进一步研究HA2、3M2e＋HA2蛋白的免疫原性和开发广谱H9N2亚型禽流感疫苗提供了理论依据。

通用流感疫苗研究进展

流感是一种对人类危害极大的传染病,接种疫苗被认为是预防流感的最有效手段。目前所用的流感疫苗主要是根据现行流行株的减毒或灭活病毒疫苗及基于流感血凝素和神经氨酸酶设计的重组蛋白质疫苗。但流感病毒变异大,易逃逸机体免疫监视,有效的疫苗须不断分离新流行株和不断更新疫苗免疫原。为解决这一问题,很多科学家一直在研究基于病毒高度保守性蛋白质、能够预防所有流感病毒毒株、可诱导持久保护性免疫的通用流感疫苗。我们对基于基质蛋白M2、核蛋白等的通用流感疫苗做一简要综述。