S2株、M5株布氏杆菌减毒活疫苗对山羊免疫效果比较试验

通过对36只不同日龄、不同性别的健康山羊（含妊娠母羊6只）随机平均分组，分别口服S2株、M5株布氏杆菌减毒活疫苗后，在7d、14d、21d、42d、90d对血液中布氏杆菌抗体进行检测，对S2、M5诱导的抗体消长动态进行分析及疫苗安全性评价，最终研究确定出S2可适用于不同日龄、不同性别山羊广泛使用，也适用于妊娠期间山羊的免疫，能有效预防布病的发生，减少由此导致的经济损失；M5可引起妊娠母羊免疫副反应及严重的流产症状。

布鲁氏菌病M5、S2疫苗免疫血清半抗原-琼脂扩散试验方法检测评价

目的应用NH-AGID方法对布鲁氏菌M5、S2疫苗株免疫血清进行检测,评价该方法适用性。方法选取3~5月龄羔羊74只,随机分为3组。分别以S2株1.0×1010 CFU、5.0×109 CFU灌服和皮下注射接种羔羊各25只,M5株以1.0×10^(9) CFU皮下注射接种羔羊24只。免疫后7 d~150 d采集羊全血,分离血清,经RBT初筛和SAT确诊免疫抗体阳性血清。评估NH-AGID方法对M5和S2株疫苗免疫抗体与感染抗体的鉴别诊断特异性。结果NH-AGID方法对M5株疫苗免疫阳性血清的LPS抗体检出率为100%,NH抗体检出率8.3%~29.2%,鉴别诊断特异性为82.8%。对S2株疫苗口服组免疫阳性血清的LPS抗体检出率为31.2%~66.7%,NH抗体检出率为0%;皮下注射组免疫阳性血清的LPS抗体检出率为45.4%~100%,NH抗体检出率为4.5%~20%。对S2株疫苗免疫血清的鉴别诊断特异性为96.5%。结论NH-AGID方法不完全适用于羊用布鲁氏菌疫苗M5株和S2株的鉴别诊断,该方法的鉴别诊断特异性与疫苗毒力、免疫剂量和途径等因素相关,应进一步研究明确该方法的适用范围及条件,以期合理应用于布病防控诊断工作中。

S2株、M5株布鲁氏菌减毒活疫苗对山羊免疫效果的比较试验

为了研究S2株、M5株布鲁氏菌减毒活疫苗对本地杂交山羊诱导的抗体消长动态规律、安全性及免疫效果,试验对36只不同日龄、不同性别的健康山羊(含妊娠母羊9只)随机平均分组,采用虎红平板凝集试验(RBPT)、试管凝集试验(SAT)方法分别对口服S2株、M5株布鲁氏菌减毒活疫苗的试验山羊,在免疫后第7,14,21,42,90天时对血液中布鲁氏菌抗体进行检测。结果表明:两种疫苗一次免疫对本地杂交山羊的最长保护期为90 d,其中S2株布鲁氏菌减毒活疫苗可适用于不同日龄、不同性别本地杂交山羊使用,也适用于妊娠期间山羊的免疫;M5株布鲁氏菌减毒活疫苗可引起妊娠母羊免疫副反应及严重的流产症状。说明较M5株布鲁氏菌减毒活疫苗,S2株布鲁氏菌减毒活疫苗具有使用方便且安全有效的优势。

布鲁氏菌病活疫苗(M5-90株)免疫绵羊试验

为掌握布鲁氏菌病活疫苗(M5-90株)免疫后的绵羊抗体水平、消长情况和不良反应发生情况,选择育肥羊和怀孕母羊各100只,分别用皮下注射免疫和点眼免疫法,开展了3个月的跟踪观察和定期检测。结果表明:布鲁氏菌病活疫苗(M5-90株)对育肥羊注射免疫后15 d的平板凝集抗体转阳率达100.0%,90 d降至22.7%;点眼免疫后15 d的平板凝集抗体转阳率达85.4%,90 d日降至0;个别3月龄以下育肥羊对注射免疫和点眼免疫均会发生一定程度不良反应,甚至死亡。活疫苗(M5-90株)对怀孕母羊皮下注射免疫后15 d的平板凝集抗体转阳率达100%,90 d降至14%;点眼免疫后15 d的平板凝集抗体转阳率达95.9%,90 d降至6.4%;注射免疫和点眼免疫均能造成一定比例的母羊流产和其他不良反应。因此,布鲁氏菌病活疫苗(M5-90株)不宜用于3月龄以下羔羊和怀孕母羊的免疫。

全反式维甲酸提高人结肠癌细胞亚株SW480/M5对奥沙利铂敏感性

目的探讨全反式维甲酸(all-trans retinoicacid,ATRA)提高人结肠癌细胞亚株SW480/M5对奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)敏感性的可能机制。方法 MTT法筛选ATRA和L-OHP实验浓度。流式细胞仪检测ATRA对肿瘤细胞周期影响。分别用ATRA、L-OHP、ATRA联合L-OHP作用SW480/M5细胞,MTT法检测药物对肿瘤细胞抑制率,流式细胞仪检测肿瘤细胞周期及凋亡率,原子光谱吸收仪检测肿瘤细胞DNA含铂(Pt)量。结果 L-OHP抑制SW480/M5细胞增殖的GI50为58.0mg/L,主要阻滞肿瘤细胞在S和G2/M期。ATRA8.0μmol/L作用24小时后,G1期细胞减少,S期细胞增多;作用72小时后,S期和G2/M期细胞增加并明显抑制肿瘤细胞增殖。8.0μmol/LATRA作用至48小时后联合L-OHP,两药联合由相加作用转变为协同作用;联合用药后S期和G2/M期细胞明显增多,细胞DNA含Pt量显著增加,呈时效依赖性。相对于单独用药,联合用药并不上调肿瘤细胞凋亡率。结论 ATRA通过改变SW480/M5细胞周期和提高细胞DNA含Pt量,明显增加肿瘤细胞对L-OHP敏感性。

羊同时注射布病M5菌苗与口蹄疫疫苗副反应观察

在甘肃河西3市6个乡镇选择90日龄以上的羊198 080只,其中怀孕羊84 160只,单独注射布氏菌病活疫苗(M5株)64 350只,同时注射布氏菌病活疫苗(M5株)和牛羊口蹄疫O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗133 730只,结果 50 d内死亡428只,流产4 460只。表明布病M5疫苗毒株毒力强,不适合用于免疫防控,更不能与口蹄疫疫苗同时注射。

羊种布鲁氏菌M5-90 omp31蛋白原核表达

克隆、测序布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白基因OMP31,原核表达OMP31并对其检测。从羊种布鲁氏菌M5-90中PCR获得OMP31基因,连接到pBS-T克隆质粒并测序;将测序正确的基因片段克隆入大肠杆菌表达载体pET-28a,进行SDS-PAGE,而后Western-blot检测。结果M5-90疫苗株的OMP31基因序列与羊种布鲁氏菌参考株16M的同源性为99.03%;外膜蛋白基因OMP31在大肠杆菌表达后能够被Western-blot检测到。结论:表达的布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白OMP31可以被布鲁氏菌特异性血清识别,表现出良好的抗原性,为以后实验室诊断和疫苗的研究做好坚实的上游工作。

原核表达山羊布氏杆菌M5-90VirB12蛋白及其在检测中的初步应用

为建立山羊布氏杆菌(Brucellar melitensis)血清学检测方法,本实验克隆了B.melitensis M5-90疫苗株的virB12基因,并表达了相应蛋白。经SDS-PAGE和western blot鉴定,重组VirB12蛋白分质量约为25ku,具有较好的抗原性。以纯化的VirB12重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法,并检测90份B.melitensis临床血清样品,检测结果与试剂盒及虎红平板凝集试验的检测结果符合率均为91.7%,结果表明,VirB12重组蛋白作为包被抗原可用于B.melitensis感染的血清检测,为进一步建立B.melitensis M5-90virB12缺失标记疫苗的鉴别检测提供方法。

响应面法优化红曲米中凝乳酶高产菌株的发酵条件

对从红曲米中分离得到的产凝乳酶能力强的菌株M5传代菌株的液态发酵培养基及产酶条件进行优化。首先进行单因素实验得到适宜的氮源为(NH4)2SO4、酪蛋白,无机盐为FeSO4、KH2PO4,适宜的接种量为1%,培养温度为30℃,培养时间为5d,发酵培养基初始pH为6.0。在此基础上通过Plackett-Burman实验筛选出对酶活影响显著的三个因素:(NH4)2SO4含量、培养时间和培养温度。再用Box-Behnken响应曲面实验对三个显著因素进行优化。结果表明,产酶的最佳培养基组分:(NH4)2SO40.53%、FeSO40.05‰、KH2PO40.05%、干酪素0.5%、葡萄糖2%、接种量1%。最佳发酵条件为:培养温度31.3℃、摇床转速为180r/min、培养时间113h、pH6.0。基于响应曲面优化的产凝乳酶培养基组成与发酵条件效果显著,供试菌株M5传代菌株所产凝乳酶活性由45.34SU/mL提高到190.68SU/mL。

牛布鲁氏菌不同种强毒株膜蛋白质组学差异的比较

[目的]比较牛的不同种类布鲁氏菌的菌株膜蛋白质组学的差异。[方法]采用丙酮干粉方法,提取布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5的全蛋白,具有双向聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,用考马斯亮蓝染色、扫描获取二维电泳图谱,用ImageMaster TM2D Platinum6.0-TOF软件筛选出差异蛋白质酶切,准备样品进行质谱分析,通过MALDI.0软件在不同的肽质量指纹质谱搜索数据库,通过生物信息技术进行蛋白质识别。[结果]应用固相pH梯度图获得良好的重复性2-DE凝胶,观察布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5 2-DE图谱,其蛋白质的表达模式非常相似,使用ImageMaster TM2D4.0软件自动识别蛋白质点,检测布鲁氏菌16 M蛋白的蛋白质点856,疫苗株M5的蛋白质点793。在数据库中选择有意义的蛋白质23种进行选择质谱鉴定。蛋白质功能的差异是由质谱鉴定得到的,涉及糖代谢、物质运输、蛋白质合成和分子伴侣等方面,有13种在16M和疫苗株M5的蛋白高表达。[结论]通过质谱鉴定,获得的蛋白质功能涉及糖代谢、物质运输、蛋白质合成和分子伴侣等,有13种在16M和疫苗株M5的蛋白高表达。

NO/ADMA在布鲁菌侵染小鼠机体过程中的响应特征

本试验旨在研究布鲁菌侵染小鼠过程中一氧化氮(NO)的作用,以及NO和非对称性二甲基精氨酸(ADMA)在此过程的相互作用关系。以布鲁菌标准疫苗株M5侵染小鼠,首先用小鼠的血清进行虎红平板凝集(RBPT)和试管凝集试验(SAT),再用Griess试剂法和ELISA法测定对照组和侵染组不同组织和血清中的NO和ADMA含量,对小鼠肝脏和脾脏的各个侵染时间段进行CFU计数观察。结果显示,用布鲁菌M5侵染小鼠后,RBPT和SAT在14d时检测到有阳性反应。侵染组和空白对照组NO总含量上变化不大,但侵染组血清中的NO含量随时间出现下降,而肝脾中NO含量随时间出现上升,其他各组织NO含量波动不明显。而ADMA的总趋势与NO相反。CFU计数结果显示,小鼠肝脾内布鲁菌的数量在14d时一直处于增长状态,28d时布鲁菌的数量下降,表明布鲁菌的分裂繁殖和机体NO的含量存在一定的关系。

布鲁氏菌病疫苗免疫评估与野毒感染区分试验

为评估布鲁氏菌基因缺失活疫苗(M5-90△26株)的安全性和免疫效果,在华池县选取阴性、阳性羊群各一群,以腿部皮下注射的方式免疫接种布鲁氏菌基因缺失活疫苗(M5-90△26株),免疫接种后30 d、90 d、120 d、150 d、180 d分别采集血清样品,用虎红平板凝集试验和试管凝集试验开展免疫效果评估,统计抗体转阳率、转阴率等指标。结果显示,M5-90△26株免疫接种30d后抗体达到峰值,以后逐渐下降,免疫90d后转阴率在80%以上,说明该疫苗具有免疫效果好、保护率高、转阴快等优点。布鲁氏菌基因缺失活疫苗(M5-90△26株)中敲除bp26基因,用布鲁氏菌病LPS和BP26蛋白ELISA抗体检测试剂盒可以对疫苗免疫阳性和野毒感染进行区分,能够为布鲁氏菌病检疫、净化提供依据,为华池县布鲁氏菌病防控提供更多参考。