Vero-2和MA-104细胞系染色体组型分析与致癌─致瘤性研究——在犬五联疫苗制备中替代BHK-21细胞系细胞株的筛选和检定

在用纯化３代的猫肾原代细胞（ＦＫＣ）和犬肾原代细胞（ＣＫＣ）皮下接种裸鼠无致癌致瘤性，以人类子宫颈癌细胞系（Ｈｅｌａ）超二倍体ＫＢ株、Ｘ株及超二倍体和亚四倍体ＮＭ２０／Ｘ株皮下接种裸鼠产生进行性恶性肿瘤比率分别为１０／１０，２５／２５和５／５的前提下，非洲绿猴肾细胞系亚二倍体（Ｖｅｒｏ２）ＪＣ株５～１９代和超二倍体ＹＡ株１２～１８代分别皮下接种２０和１０只裸鼠，均未产生肿瘤，恒河猴肾细胞系亚四倍体（ＭＡ１０４）ＪＣ株４代皮下接种５只裸鼠亦未产生肿瘤。不同株的Ｈｅｌａ和地鼠肾细胞系（ＢＨＫ２１）在３．３ｇ／Ｌ琼脂中均具有抛锚独立生长特性，并在终浓度３．１２５～２００ｍｇ／ｍＬ植物凝集素（ＰＨＡ）作用下出现凝集现象，而ＦＫＣ、ＣＫＣ及Ｖｅｒｏ２细胞系ＪＣ株、ＹＡ株既不具有抛锚独立生长特性，在不同浓度ＰＨＡ作用下也不发生凝集，符合非肿瘤源性细胞的特性。因此，Ｖｅｒｏ２细胞系ＪＣ株可用作病毒疫苗毒株的传代培养，而Ｖｅｒｏ２细胞系ＹＡ株和ＭＡ１０４细胞系ＪＣ株则不适宜。

猪A组轮状病毒Vp4全基因在MA-104细胞中的表达与DNA疫苗的研究

本研究采用LipofectamineTM2000将真核重组表达质粒pVAXI-Vp4转染至MA-104细胞中,得到了表达。以荧光抗体检测法和RT-PCR法双重检测了真核重组表达质粒pVAXI-Vp4在MA-104细胞中的表达情况。并将pVAXI-Vp4免疫BALB/c鼠,检测其血清抗体和脾脏中的淋巴细胞增殖情况及CD4+,CD8+T细胞的数量变化情况。结果表明,猪A组轮状病毒Vp4全基因不但在哺乳动物细胞中获得了表达,而且将真核重组表达质粒pVAX-I-Vp4给动物免疫后,获得了免疫效果。这为pVAXI-Vp4DNA核酸疫苗的进一步推广应用提供了科学依据。

过表达非洲猪瘟病毒D1133L蛋白的MA-104细胞系建立及其初步应用

旨在研究非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)编码的D1133L基因功能,本文利用慢病毒表达系统构建了过表达D1133L的MA-104/D1133L细胞系,分析ASFV在MA-104/D1133L细胞系与MA-104细胞中的复制差异。利用RT-qPCR和Western blot技术分别检测了ASFV感染MA-104/D1133L细胞后p30和p72基因的转录和蛋白表达水平,同时测定病毒滴度和病毒拷贝数评价ASFV的复制能力。结果表明:ASFV p30和p72基因在MA-104/D1133L细胞系的转录和蛋白表达水平高于野生型细胞系,ASFV在MA-104/D1133L细胞系的病毒增殖能力高于野生型细胞。本研究成功构建了过表达ASFV D1133L基因的MA-104/D1133L细胞系,与野生型细胞相比,D1133L能促进ASFV增殖,MA-104/D1133L细胞系更利于ASFV的复制,本结果为进一步研究ASFV D1133L基因功能积累了生物材料。

流行性出血热病毒在MA-104和Vero-E6传代细胞上繁殖动态的比较

用流行性出血热病毒(陈株)分別感染MA-104和Vero-E6传代细胞,结果受病毒感染的MA-104细胞荧光阴性细胞出现早,感染滴度高,胞浆内颗粒大,提示MA-104细胞用于该病毒的分离传代及抗原片的制作等方面优于Vero-E6细胞。流行性出血热病毒(EHFV)在某些原代及传代细胞上能适应增殖,国内外已有过报导。但用对轮状病毒十分敏感的恒河猴胚肾MA-104细胞培养和增殖EHFV并与通常使用分离该病毒的VeroE6细胞进行繁殖动态观察,尚未有过报导。本文用间接免疫荧光法(IFA)比较观察EHFV在两种细胞上的增殖动态,为MA-104细胞代替常规Vero-E6细胞用于该病毒的分离、传代等研究以及抗原片的制备提供依据。

猪轮状病毒HeBei-12株在MA-104细胞上最适繁殖时间的摸索

本试验将He Bei-12株猪轮状病毒在MA-104细胞上培养,通过对病毒的细胞培养物进行核酸提取及RT-PCR检测证明,该病毒可以很好的适应细胞。为获得最佳的病毒培养量,本试验分别从间接免疫荧光,增殖动力学曲线以及病毒感染细胞后的超薄切片电镜对病毒的繁殖周期做了初步研究。结果表明,He Bei-12株猪轮状病毒在感染MA-104细胞时,病毒粒子是随着时间的变化而变化的,当病毒接种20 h时即可在细胞质中观察到病毒粒子。当病毒感染细胞64 h时,滴度达到最大值4.8 log TCID50/m L,此后滴度逐渐下降。本试验对猪轮状病毒地方流行株He Bei-12株在MA-104细胞上的最佳繁殖时间进行摸索,为进一步研究其生物学特性和疫苗研制奠定了基础。

新生牛小肠粘膜细胞轮状病毒受体的研制Ⅱ、抗BRV受体McAb对MA104细胞的保护试验

在生长成单层的MA104细胞中加入抗BRV受体McAb,及用抗-BRV中和后的抗BRV受体McAb,37℃作用1小时,再感染BRV。结果表明抗BRV受体McAb既能保护MA104细胞不受BRV的感染,又能代替BRV和抗-BRV发生抗原抗体的特异性结合反应。同时表明我室建立的筛选杂交瘤细胞的ELISA法的可靠性。

仔猪轮状病毒FQ-PCR检测方法的建立

目的探讨动物轮状病毒分离鉴定方法 ,建立实时荧光定量PCR(FQ-PCR)快速检测法。方法用RV敏感的MA-104细胞分离病毒,测定其VP6基因序列和同源性分析,建立FQ-PCR检测方法。结果 MA-104细胞接毒并传代18h后出现明显的细胞病变(CPE),分离到1株猪轮状病毒(PRV),经RT-PCR扩增得到1200bp的VP6片段,与标准株(AV-55)的同源性达88.50%;且建立了PRV的FQ-PCR检测方法 ,其灵敏度比普通PCR高数十倍,具有较强的特异性。结论建立了PRV的FQ-PCR检测方法 ,其灵敏度和特异性比普通PCR高数十倍,PRV的VP6与参考株具有88.50%同源性,建立了PRV的FQ-PCR检测方法 ,其灵敏度和特异性普通PCR和ELISA均高。

猪轮状病毒的细胞培养特性研究

目的:探讨动物轮状病毒细胞培养的特性和适宜条件,为研发诊断试剂盒和疫苗奠定基础。方法:制备三种细胞培养液(A、B、C组),经对MA-104细胞培养,确定最适培养液,高倍光镜下观察细胞形态的变化。结果:MA-104细胞用含10%小牛血清加高糖DMEM的培养液(C组)培养时贴壁较快,生长良好,成本较低。传代18h后出现明显的细胞病变(CPE),细胞膜缩融合、细胞层裂开、出现细胞核固缩,空泡化、染毒的细胞出现大片脱落区域,最后细胞死亡脱落,随传代次数增加,病变程度加深,CPE出现时间加快。没有脱落的细胞出现拉网现象。当CPE达到90%的时候开始收毒。结论:PRV在MA-104细胞中能良好生长,培养的最佳条件为37℃5%CO2,2-3d,传代18h后出现CEP,随传代次数增加,病变程度加深。

牛轮状病毒的分离与细胞培养特性

探讨牛轮状病毒(BRV)的细胞培养方法,为研发诊断试剂盒和疫苗提供依据.将RT-PCR阳性样品在MA-104细胞及Vero细胞上进行培养,盲传4代后MA-104细胞出现病变(CPE),主要表现为细胞脱落,出现拉网现象,部分出现死亡.这表明轮状病毒能够在MA-104细胞上生长,并引起细胞病变;而Vero细胞无病变.用胰酶处理的病毒接种MA-104细胞,用含2μg/mL、3μg/mL和5μg/mL三种(A、B和C)不同浓度胰酶的培养液在MA-104和Vero细胞对犊牛轮状病毒传代培养.将分离培养的病毒经聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果表明BRV在C组培养液中分离培养最好,聚丙烯酰胺凝胶电泳图显示病毒核酸呈4∶2∶3∶2排列,与参考株NCDV相似,呈典型A群轮状病毒的特征.

轮状病毒生物学特性的研究

用MA—104细胞培养常用的3个轮状病毒(RV)标准株(人Wa株、牛NCDV株、猴SA_(11)株)进行形态学、培养特性及理化性质比较观察,3株细胞培养特性基本相同,在电镜下呈RV特有的形态结构,RNA电泳图具有典型的电泳区带分布模式,表明RV的生物学性质有较高的稳定性。

A群轮状病毒NSP5蛋白在细胞器中定位特性

为研究A组猪轮状病毒(Po RV)非结构蛋白NSP5在MA-104细胞中的定位情况,本研究将NSP5蛋白基因克隆于表达载体p EGFP-C2中构建重组质粒p EGFP-NSP5,将其转染于MA-104细胞中进行NSP5瞬时表达,并于转染48 h后利用激光共聚焦显微镜分析NSP5表达蛋白在细胞中的定位情况。结果表明,表达蛋白在MA-104细胞中的线粒体、内质网、高尔基体中均有分布,主要定位于细胞质。本研究为进一步分析病毒的复制和致病机理提供依据。

动物细胞系的染色体组型与遗传变异率分析

在建立国内首家犬、猫、猴、鼠传代细胞库，即７种动物肾细胞系（Ｆ－８１、ＣＲＦＫ、ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ、Ｖｅｒｏ－２、ＭＡ－１０４、ＢＨＫ－２１）的种子库和工作库的基础上，通过细胞染色体组型、Ｇ带核型、染色体数目变异率、结构畸变率分析，了解７种细胞系传代培养不同代次的染色体变异情况。以相应的细胞株皮下接种裸鼠形成肿瘤实验、软琼脂细胞克隆形成率与植物凝集素作用下细胞凝集实验为对照，筛选出无致癌／致瘤性、符合细胞遗传学要求、无传染因子污染的细胞系（Ｆ－８１、ＣＲＦＫ、Ｖｅｒｏ、Ｖｅｒｏ－２）或极低致癌性的ＭＤＣＫ细胞系用于制苗，发现肿瘤细胞系高变异率株可在裸鼠体内快速选育成功。细胞系染色体遗传特征决定致瘤性质并具有种属特异性，得到一些１００％成瘤和１００％不成瘤的细胞株并探讨了与染色体组型的关系。对于肿瘤的发病机理及实验治疗，都是非常好的模型。一些细胞系不仅成瘤而且还可转移（致恶性横纹肌样瘤的ＢＨＫ－２１和Ｖｅｒｏ细胞株），其他致瘤细胞株只成瘤不转移或不明显转移。

黑龙江省犊牛腹泻粪便中轮状病毒的分离与鉴定

用MA—104细胞,以静止培养条件,从1月龄内的犊牛腹泻粪便中,分离出4电轮状病毒。经传至4～6代均使感染细胞出现特征性细胞病变。经直接电镜和免疫株镜观察,见有典型的轮状病毒颗粒,其RNA电泳型与NCDV株一致,以抗NCDV株高免血清琼扩检测及轮状病毒ELISA检测均为阳性。这4株病毒分别命名为DNRV_1,DNRV_2,DNRV_3,DNRV_4。

犊牛腹泻轮状病毒在3个传代细胞上培养特性的研究

对犊牛腹泻轮状病毒（ＮＣＤＶ）在３种传代细胞系上进行了培养，并将其培养特性进行了比较研究。结果表明：犊牛腹泻轮状病毒在ＭＡ－１０４细胞上生长，其病毒抗原的生长部位在细胞浆，培养后可出现细胞病变；犊牛腹泻轮状病毒在ＬＬｃ－ｍｋ２细胞上也生长，且随着培养代次的增加，病毒抗原的滴度相应增加，增长到一定滴定后即较稳定。

模拟电子开关阵列的测试系统设计

市场上的线缆测试仪大多采用电磁继电器阵列,功能强大,价格昂贵。以PC/104嵌入式工控机和QNX嵌入式操作系统为核心,采用模拟电子开关式线缆端点选择阵列和基于可编程逻辑器件(CPLD)的线缆端点扫描控制电路,设计实现了一种小型、经济实用的线缆组件自动测试系统。最后对测试系统进行了试验验证,并对其主要性能参数进行了分析。

大黄提取物和大黄素体外抗轮状病毒的实验研究

目的研究大黄提取物、大黄素体外对轮状病毒的作用,为临床上治疗轮状病毒的感染提供理论依据。方法用人轮状病毒R709株感染恒河猴肾细胞(MA-104),通过光镜观察细胞病变效应(CPE),并结合噻唑蓝(MTT)比色法,采用治疗指数(TI)作为药物体外抗病毒效果的评价指标。以利巴韦林为阳性对照,从药物对病毒入侵细胞的阻断作用、直接灭活作用及增殖抑制作用3种方式分别检测大黄提取物、大黄素体外对轮状病毒的作用效果。结果在轮状病毒感染细胞不同阶段加入大黄提取物后,病毒诱导的CPE程度明显减轻,且有量-效关系。用MTT法检测细胞活性,计算大黄提取物对轮状病毒入侵细胞的阻断作用、直接灭活作用及对病毒增殖抑制作用的半数有效浓度(IC50)分别为:(101.08±1.57)mg/L、(111.27±4.94)mg/L、(46.88±3.50)mg/L;三种作用方式的治疗指数(TI)分别为:(3.13±0.13)、(3.45±0.06)、(7.45±0.56)。大黄素混合液对轮状病毒三种作用方式的抑制作用的IC50分别为:(35.94±6.80)mg/L、(12.25±0.93)mg/L、(13.65±1.08)mg/L;TI分别为:(0.37±0.07)、(1.07±0.08)、(0.95±0.08)。结论大黄提取物在体外具有较好抗轮状病毒作用,大黄素对轮状病毒的作用不明显。

猪轮状病毒的细胞培养特性与FQ-PCR检测方法的建立

为了探讨动物轮状病毒的细胞培养特性和分离方法,建立FQ-PCR检测方法,旨在为研发诊断试剂盒和疫苗奠定基础。37℃5%CO_2下用细胞培养液C培养ELISA检测的阳性猪粪便样本,观察细胞形态的变化;用RV感染MA-104细胞,分离纯化病毒,测定VP6基因序列并分析其同源性,在普通PCR和实时定量PCR的基础上,建立FQ-PCR检测方法。结果,MA-104细胞培养的最佳条件为37℃5%CO_2;接毒后18 h出现细胞膜缩融合、细胞层裂开、细胞核固缩及空泡化等明显的细胞病变(CPE),CPE达到90%时可收毒;分离到1株猪轮状病毒(暂命名为GSPRV01株),得到VP6为1 200 bp,与标准株(AV-55)的同源性为88.50%。