用MAB-ELISA对仔猪母源猪瘟抗体的试验

用猪瘟兔化弱毒苗4头份免疫后的母猪3头,分别于分娩后定期日龄采血分离24头份血清样品;初生仔猪16头,分别于出生后定期日龄前腔静脉采血分离128头份血清样品,用单抗酶联免疫吸附试验检测血清猪瘟抗体滴度。结果表明,母猪猪瘟抗体效价持续较高,达100%保护率;哺乳前仔猪抗体效价为0,吃初乳后抗体水平不断提高,但抗体总体效价较低,仅有57.89%的保护率;仔猪20日龄前母源抗体水平差异较大,与母猪抗体水平不呈正相关。

人C-反应蛋白磁微粒化学发光酶免疫测定法的建立

人C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是炎症以及各种相关疾病如病毒感染、心血管疾病等诊断、治疗和预后的临床检测指标。为了建立一种快速、准确的CRP定量免疫测定方法,将表达纯化的重组CRP作为抗原免疫小鼠,获得了5株稳定分泌抗体的单克隆抗体细胞株,采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)初步鉴定筛选的抗人CRP单克隆抗体,并分别选择mAb 9D6和mAb 9G4作为捕获抗体与检测抗体,建立用于人CRP检测的化学发光酶免疫测定法(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA),最后通过测定分析临床血清CRP样本,评价CLEIA的性能。结果显示,基于9D6/9G4-AP单克隆抗体对的CLEIA测定范围为0.1767~500μg/L(可扩展至100 mg/L);所建立的CLEIA与医院采用的免疫散射比浊法(R^(2):0.9496,P<0.0001)表现出良好的相关性,且Bland-Altman分析中96.36%(106/110)的点在95%一致性界限范围内显示两种检测方法具有较好的一致性。结果初步表明,建立的分析方法在临床诊断中具有较好的应用前景。

检测牛IL-4双抗体夹心ELISA方法的建立

为利用牛白细胞介素-4(BoIL-4)的特异性单克隆抗体(MAb)建立检测BoIL-4的双抗体夹心ELISA方法,以多种ELISA方法对7株抗BoIL-4的单抗进一步筛选,得到反应最佳的2株单抗8B7和4A10,以A9表达的重组BoIL-4为阻断剂的阻断ELISA试验中,表明这2株单抗也可识别所构建的细胞系A9表达的重组BoIL-4。以单抗8B7作为包被抗体,以标记了HRP的单抗4A10作为检测抗体建立的双抗体夹心ELISA方法可检测大肠埃希菌、毕赤酵母和Flp-In-293细胞系3种表达系统表达的重组BoIL-4,最低检测限分别为0.25、8和2 ng·mL^(-1),且对A9细胞系上清中表达的BoIL-4检测效果和特异性良好。该研究建立的BoIL-4双抗体夹心ELISA方法为深入研究BoIL-4、开发BoIL-4 ELISA检测试剂盒奠定了基础。

高致病性H5亚型禽流行性感冒病毒血凝素单克隆抗体的制备与初步应用

以禽流感病毒株Ck/HK/Yu22/02(H5N1)作为免疫原,利用常规杂交瘤技术和血凝抑制试验法成功地筛选出6株稳定分泌抗高致病性H5亚型禽流感病毒血凝素的单克隆抗体(单抗),分别命名为2F2、3C8、3FC1、7C6、10HD4和13G4。经血凝抑制试验法分析,结果发现这6株单抗具有特异性高、反应性强、识别谱宽且互补等特点。基于单抗2F2,初步建立了三种H5N1病毒诊断方法,经评估证实均具有很好的特异性。由此说明,研究制备的抗H5亚型禽流感病毒血凝素单抗可适用于H5N1病毒的诊断。

抗重金属Cr^(3+)单克隆抗体的制备及其应用

目的:制备重金属Cr3+的单克隆抗体(mAb)并建立间接竞争ELISA法,用于Cr3+的检测。方法:用合成的重金属铬-螯合剂-BSA抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、克隆化和ELISA等技术建立杂交瘤细胞株;腹水型mAb经硫酸铵沉淀纯化后建立间接竞争ELISA法并与9种金属进行交叉实验;水样加标后,进行间接竞争ELISA法与ICP-AES法检测Cr3+的比较,计算两种方法符合率。结果:获得3株稳定分泌抗重金属Cr3+mAb的杂交瘤细胞株,其中5G12C5株mAb间接ELISA效价>1∶1×105,间接竞争ELISA法检测Cr3+的范围为0.783~50μg/L,最低检测限为1μg/L,与Fe3+存在<10%交叉,而与其他金属无交叉反应;当水样中加标量>1μg/L时,间接竞争ELISA法与ICP-AES法检测Cr3+的符合率达96.95%。结论:获得效价高、特异性强的重金属Cr3+mAb,初步建立了检测Cr3+的间接竞争ELISA法,该方法检测的灵敏度可达到国家地下Ⅰ类水的检测标准(0.005 mg/L)。

植酸酶单克隆抗体的制备及鉴定

通过细胞融合建立分泌抗植酸酶单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株。采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明,筛选出2株杂交瘤细胞,其中,5C3细胞株产生单抗亚型为IgG1型,效价为1∶(1.02×106),IC50=100.07 ng/mL,亲和常数为6.70×109L/mol,与市售常规植酸酶、包被植酸酶及浓缩植酸酶的IC50分别达到130.43,126.16,125.33 ng/mL,交叉反应率分别为76.72%,79.32%和79.84%。与高温失活(100℃水煮5 min)的麸皮植酸酶、普通植酸酶、包被植酸酶及浓缩植酸酶IC50分别为4 205.45,4 015.86,3 593.19,3 610.40ng/mL,交叉反应率分别为2.38%,2.49%,2.78%,2.77%。说明成功筛选了杂交瘤细胞株,该细胞株能分泌抗植酸酶mAb,该植酸酶mAb对植酸酶亲和力高、特异性强、灵敏度好,为植酸酶ELISA检测试剂盒及试纸条研制奠定了基础。

单克隆抗体捕捉猪瘟病毒抗原ELISA方法的建立

分别用原核表达的猪瘟病毒(CSFV)主要抗原E2蛋白和猪瘟基因疫苗免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合与克隆筛选出5株稳定分泌CSFV抗体的杂交瘤细胞株1E2、1G7、3A2、3B7和4B6。间接免疫荧光和Western-blotting试验结果表明,5株单抗均与CSFV E2蛋白和全病毒抗原反应。将筛选的CSFV特异性单抗1E2、3B7和4B6纯化后等量混合后包被酶标板(捕捉抗体),与兔抗CSFV IgG(检测抗体)联合应用,建立起CSFV抗原捕捉ELISA(AC-ELISA)方法。随后采用方阵滴定法确定了单抗与多抗的最适工作浓度及判定检测结果的OD450临界值。最后以建立的AC-ELISA检测CSFV细胞培养物、CSFV攻毒死亡猪的病料和临床猪瘟组织样品,结果表明,该方法敏感、特异、重复性好,与病毒分离和RT-PCR方法符合率分别为86.2%和90.3%。

抗牛碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的 :制备抗牛碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)单克隆抗体(mAb) ,并鉴定其亚类 ,建立ELISA检测bFGF含量的方法。方法 :应用基因重组的牛bFGF免疫BALB/c小鼠 ,通过细胞融合 ,建立分泌抗bFGFmAb的杂交瘤细胞株。应用免疫沉淀技术鉴定抗bFGFmAb的亚类 ;应用基因重组的牛bFGF免疫青紫蓝兔 ,制备抗bFGF的多抗血清 ;将抗bFGFmAb及兔抗血清用ProteinA亲和层析纯化后 ,建立检测bFGF含量的ELISA方法。结果 :共获得 3株稳定分泌抗bFGFmAb的杂交瘤细胞株 ;它们所分泌的mAb均为IgG1;采用夹心ELISA法检测bFGF的敏感性达ng水平。 结论 :抗bFGFmAb(IgG1)

牛γ-干扰素ELISA检测方法的建立与初步应用

以纯化的rHis-BoIFN-γ制备兔多抗血清,辛酸—硫酸铵两步法对体内诱生的抗rBoIFN-γ单抗腹水进行纯化,用美洲商陆素(Pokeweed mitogen,PWM)刺激奶牛全血产生的分泌性天然BoIFN-γ筛选出与之反应最佳的单抗5E11。将单抗5E11以40μg/mL浓度包被,与1∶3 000倍稀释的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清(13.8μg/mL)配对,以1∶6 000稀释的商品化酶标羊抗兔IgG为指示抗体,建立了BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法,该方法可以检出2.56 U/100μL(30.5 pg/100μL)的rHis-BoIFN-γ、8U/100μL的rBac-BoIFN-γ和1U/100μL的分泌性天然BoIFN-γ。以商品化试剂盒作为平行对照,将获得的奶牛临床检测血浆样品使用BoIFN-γ抗原捕获ELISA法进行检测,结果显示两种方法检测符合率达到83.9%。本研究建立的BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法可有效检测分泌性IFN-γ,为进一步开发BoIFN-γELISA检测试剂盒奠定了基础。

IL-31单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

目的:制备抗人IL-31单克隆抗体,建立ELISA检测体系。方法:采用合成免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备抗IL-31单克隆抗体,用HRP标记单克隆抗体,ELISA和Western blot法检测抗体的亚类、滴度和特异性;采用ELISA技术制备IL-31检测试剂盒,并对自制试剂盒进行评价。结果:获得了两株稳定产生抗IL-31单克隆抗体的杂交瘤细胞,抗体亚类均为IgG3,抗体特异性好,杂交瘤细胞诱生的腹水抗体效价达106。试剂盒检测灵敏度为5.726 pg/ml,检测IL-1、IL-6、TNF-α、RF的P/N值均小于2.1,为阴性,靶抗原IL-31的检测结果为阳性(P/N值=13.76);自制试剂盒检测特应性皮炎血清IL-31水平为(532.83±90.39)pg/ml,对照组血清IL-31水平为(103.31±19.17)pg/ml,皮炎组明显高于对照组,有显著性差异(P<0.001)。结论:成功制备了抗IL-31单克隆抗体,建立的ELISA试剂盒可用于临床检测IL-31。

Asia Ⅰ口蹄疫vp2蛋白单克隆抗体的制备及单抗竞争ELISA方法的建立

制备AsiaI口蹄疫病毒vp2单克隆抗体(mAb)并建立了单抗竞争ELISA方法。用纯化的AsiaI型口蹄疫病毒vp2重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合,采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞。分别用ELISA、Western blotting检测mAb腹水的效价及其特异性。筛选到杂交瘤细胞2株,腹水效价均在100×29以上;以纯化后的AsiaI型口蹄疫病毒vp2重组蛋白作为抗原,利用AsiaI型口蹄疫病毒vp2单抗酶标物建立了竞争ELISA方法用来检测AsiaI型口蹄疫抗体。临床应用表明,该方法与UBI公司的口蹄疫全病毒抗体检测试剂盒总符合率达89.0%,和荷兰赛迪公司的口蹄疫病毒LPB-ELISA抗体检测试剂盒总符合率达86.5%。

抗弓形虫速殖子单克隆抗体的制备与特性研究

目的制备抗弓形虫速殖子单克隆抗体（Mab），并对其特性进行分析，探讨其在弓形虫病诊断中的作用。方法利用杂交瘤技术制备抗弓形虫速殖子Mab。用间接ELLSA法测定活性，以琼脂糖免疫双扩散鉴定亚类，通过SDSPAGE和Westemblot分析该Mab，所识别的抗原分子量，以IFA确定抗原位点在虫体的定位，并对其保护性及特异性进行分析。通过Mab-ELISA法检测弓形虫抗原，以研究其在弓形虫病血清学诊断中的意义。结果抗弓形虫MabF7C8H12属IgG1亚类，识别抗原的分子量为16．5和24kDa。以固定的完整虫体进行IFA，未显示荧光。竞争抑制试验显示50％抑制率时的抗原浓度为40μg／ml。将RH株速殖子与Mab腹水进行孵育后接种子小鼠腹腔，并不能延长小鼠的平均死亡时间。以Mab-ELISA法检测人工溶于PBS和正常人血清中的弓形虫RH株速殖子抗原，最小检出量为0．78μg／ml和1．5μg／ml。RH株速殖子103／只感染小鼠，分别于第6d和第8d能检出循环抗原。结论抗弓形虫速殖子MabF7C8H12是研究弓形虫和弓形虫病的很好探针，其应用前景值得进一步研究。

抗人μ链单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备高效价的鼠源性抗人μ链单克隆抗体(mAb),并建立可用于感染性疾病早期血清学诊断的ELISA捕捉法。方法:以人IgM全分子免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,用间接ELISA法筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗μ链mAb的杂交瘤细胞株。mAb的特性(效价、Ig亚类、特异性及相对亲和力)采用ELISA及Westernblot法鉴定。以纯化的mAb包被建立ELISA捕捉法,并用于可疑乙脑患者标本中特异性IgM抗体的检测。结果:筛选到1株可稳定分泌抗人μ链mAb的细胞株2E5。mAb腹水的ELISA效价为1×10-6,Ig亚类(型)为IgG1(κ),相对亲和力为1×10-5。Westernblot结果显示mAb2E5仅与IgM的μ链结合,Mr为75000。以辛酸硫酸铵法纯化的mAb2E5包被,建立了ELISA捕捉法,用于30份乙脑患者血清IgM的检测,敏感性及特异性良好。结论:成功地制备1株抗人μ链mAb2E5,建立了可用于感染性疾病早期血清学诊断的ELISA捕捉法。

鸡传染性法氏囊病病毒单克隆抗体的研究

用纯化的鸡传染性法氏囊病病毒 ( IBDV) CA毒株和 B87株混合抗原脾内免疫 BALB/C小鼠 ,取其脾细胞与 SP2 /0骨髓瘤细胞融合 ,采用间接 ELISA方法进行筛选 ,共检出 31个原始阳性孔 ,阳性率为 1 5.4%。选择其中 3个孔 ,分别进行 3次克隆 ,最后获得 3株杂交瘤细胞 ,命名为 B2 8、B3 4、C2 8。通过与其它禽源病毒的交叉试验证明 ,分泌的抗体均具有高度特异性。3株细胞的平均染色体数分别为 94、87、89条。3种单克隆抗体均无免疫沉淀特性。相加 ELISA试验结果表明 ,3种单克隆抗体识别的是病毒抗原上互不相同的表位。3株杂交瘤细胞的细胞上清和小鼠腹水单克隆抗体的ELISA效价分别达 1 :1 2 8～ 2 560和 1 0 -3～ 1 0 -6,其中 B3 4显著高于另 2株。通过中和试验证明 ,仅 B3 4单克隆抗体能特异中和 IBDV CA株。连续培养 2 1代 ,B3

传染性胰坏死病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

以纯化的兔抗传染性胰坏死病病毒(IPNV)VP2重组蛋白多克隆抗体为包被抗体,抗IPNV VP2单克隆抗体为检测抗体建立了IPNV双抗体夹心ELISA方法。优化反应条件为:兔抗IPNV VP2重组蛋白多克隆抗体包被浓度为1.28μg/mL,抗IPNV VP2单克隆抗体的工作浓度为1.34μg/mL,酶标二抗稀释比例为1∶2 000,以P/N>2,且OD490 nm>0.101 494作为阳性判定标准。该方法的重复性变异系数均小于10%,与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、轮状病毒(HRV)无交叉反应。对41份虹鳟肝脏样品分别进行双抗体夹心ELISA和RT-PCR检测,结果双抗体夹心法与RT-PCR法检测符合率为97%,表明本实验建立的双抗体夹心ELISA检测方法检测IPNV具有较高的敏感性和特异性,可用于IPNV的病原学检测。

抗青霉素单克隆抗体的制备及初步应用

目的:制备抗青霉素的单克隆抗体(mAb)并建立双抗体夹心ELISA检测方法,对临床上引起青霉素过敏反应的过敏原青霉噻唑蛋白进行研究。方法:将半抗原青霉素和载体蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术建立稳定分泌抗青霉素mAb的杂交瘤细胞株。常规制备腹水,用辛酸-硫酸铵法纯化,并对纯化的mAb进行特异性鉴定。通过对不同抗体组合的分析和条件的优化,建立检测过敏原的双抗体夹心ELISA方法。结果:经细胞融合、筛选及克隆化,共获得9株稳定分泌抗青霉素mAb的杂交瘤细胞株,其中5株亲和力较高。建立了双抗体夹心ELISA相对定量检测方法,该方法灵敏度达到870 U/L,平均回收率为107.81%,批内变异系数平均为6.7%,批间变异系数平均为9.3%,可用于A群链球菌制剂中青霉噻唑蛋白的检测。结论:成功地制备了抗青霉素的mAb,并建立了相对定量检测青霉噻唑蛋白的双抗体夹心ELISA法。

抗大肠埃希氏菌F41粘附素特异单克隆抗体的研制及其初步应用

应用杂交瘤技术获得7株能稳定分泌 F41特异单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为L10、B10、C32、B1、E7、E40和 B49。在直接凝集试验、酶联免疫吸附试验和间接荧光试验中,这7株单克隆抗体对所试的31株肠道菌中所有 F41阳性菌株都发生反应,与 F41阴性菌株则无反应性。抗原竞争 ELISA 试验结果发现,这些单克隆抗体是针对 F41粘附素上相同或十分相近的抗原决定簇。采用胶体金标记技术和免疫电镜证实,这些抗原决定簇在 F41粘附素的每条纤毛上多次重复出现。体外肠吸附抑制试验表明,7株 F41特异单克隆抗体对 B41M 菌株具有很强的抑制能力,对 B41菌株则必须用 F41和 K99单克隆抗体同时作用才具有完全的肠吸附抑制效果。本文用直接酶标单克隆抗体建立的酶联免疫斑点试验具有高度的特异性和灵敏性,可广泛用于现场快速诊断。

基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

为制备基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)单克隆抗体(MAb),本研究根据DHAV-C ORF编码氨基酸序列与基因A型DHAV(DHAV-A)相应序列比对结果,利用生物信息学软件筛选位于DHAV-C ORF编码蛋白序列上的不同抗原表位,合成5条十肽表位序列,分别与KLH载体蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠,经细胞融合筛选获得5株稳定分泌抗DHAV-C MAb杂交瘤细胞株。Western blot显示,5株MAb均能够与DHAV-C发生特异性反应,其中5H24-9、3E18-4和5E3-9 3株MAb不与DHAV-A、鸭瘟病毒、新城疫病毒和禽流感病毒反应,为DHAV-C的特异性MAb,同时也证明与这3株MAb结合的十肽序列为DHAV-C的抗原表位。这3株MAb亚类分别为IgG2b、IgG1和IgG2b。MAb的制备为建立DHAV-C的检测方法和致病机理奠定了基础。

重金属镉单克隆抗体的制备与性质分析

通过双功能螯合剂iEDTA螯合Cd2+并偶联卵白蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA),合成免疫抗原Cd-iEDTAOVA和筛选抗原Cd-iEDTA-BSA;以Cd-iEDTA-OVA注射BALB/c小鼠,制备Cd2+单克隆抗体,以Cd-iEDTA-BSA通过酶联免疫吸附法(ELISA)进行筛选,并分析抗体性质。结果表明:以Cd2+和OVA含量分别为174.6230μg/L、1.7892mg/mL的Cd-iEDTA-OVA抗原免疫小鼠,Cd2+和BSA含量分别为48.1881μg/L、1.8065mg/mL的Cd-iEDTA-BSA抗原筛选,可获得7F4和7E8两株特异性较好的杂交瘤细胞;7E8E5、7E8G9、7F4B8、7F4D6和7F4H8共5株高纯度单抗,均属IgG1型,其中7E8E5效价最高,达1:512000,亲和常数也最高,达4.55×108L/mol。建立了Cd2+间接竞争ELISA法,IC50为1150ng/mL,检测限为260ng/mL(R2=0.9916);与Hg2+有较强交叉,与Zn2+、Cu2+、Ca2+交叉较弱,与Mg2+、Ni2+、Al3+、Pb2+、Ba2+几乎无交叉。

抗胰蛋白酶原激活肽单克隆抗体的制备及应用

目的 :制备抗胰蛋白酶原激活肽 (TAP)单克隆抗体 (TAPmAb) ,并建立敏感、特异的TAP免疫检测方法。方法 :将人工合成的TAP与血蓝蛋白 (KLH)交联制成免疫原 ,免疫BALB/c小鼠 ,取其脾细胞与Sp2 / 0细胞融合 ,间接ELISA筛选阳性克隆 ,经多次克隆化 ,获得稳定分泌TAPmAb的杂交瘤细胞株 ,并进行鉴定 ,进而建立检测TAP的ELSIA竞争法。结果 :获得10株能稳定分泌TAPmAb的杂交瘤细胞株 ,除 1株为IgG1外 ,余 9株均为IgM类 ;效价达 1∶10 5～ 1∶10 6;与BSA、人白蛋白、胰蛋白酶原、淀粉酶均无交叉反应 ,中和抑制试验表明培养上清、腹水中的抗体能明显被TAP中和。建立了检测TAP的ELISA竞争法 ,灵敏度为 0 .6 9μg/L ,批内变异系数为 9.10 % ,批间变异系数为 10 .33%。用该法测定急性胰腺炎组患者及对照组患者TAP含量分别为 5 7.35 μg/L及 9.30 μg/L (P <0 .0 1)。结论 :成功制备抗TAPmAb ,并建立了敏感的ELISA竞争法。