人端粒酶催化亚基启动子联合mad1基因体外抑制膀胱癌细胞的研究

目的探讨人端粒酶催化亚基(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)启动子联合mad1基因对膀胱癌细胞T24和EJ细胞的生长抑制作用及机制。方法采用细胞计数、电子显微镜、流式细胞术、RT-PCR及免疫组化等方法,观察hTERT启动子联合mad1基因表达质粒转染T24和EJ细胞后的膀胱肿瘤细胞的增殖能力、生长周期、细胞超微结构的变化以及hTERT和TGF-β1mRNA基因和蛋白表达影响。结果转染hTERT启动子联合mad1基因后对T24和EJ细胞生长有明显抑制作用、出现凋亡小体和细胞周期相的改变,S期细胞明显减少,G0/G1期细胞明显增多,下调T24和EJ细胞hTERT和TGF-β1的mRNA表达,并能抑制hTERT和TGF-β1蛋白表达。结论hTERT启动子联合mad1基因能够抑制膀胱肿瘤细胞的增殖能力,可望为膀胱癌基因治疗提供新思路。

MAD1基因在主动脉夹层中的表达及对主动脉平滑肌细胞的影响

收集病变的升主动脉中膜组织标本为主动脉夹层组;收集同期在本院行尸检且无手术史、大血管病变史的升主动脉壁内组织标本18份为对照组;RT-PCR和Western blot检测有丝分裂阻滞缺陷蛋白(MAD1)mRNA和蛋白表达水平。在体外建立MAD1基因高表达人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMC)模型,检测细胞增殖和凋亡情况以及凋亡相关蛋白。结果显示主动脉夹层组患者主动脉夹层中MAD1 mRNA和蛋白相对表达量明显高于对照组(P<0.05)。随着转染时间的延长,各组细胞增殖水平均逐渐增加,转染48 h、72 h后MAD1过表达组细胞增殖情况低于空白对照组及空载体转染组(P<0.01)。转染48 h后,MAD1过表达组细胞凋亡率明显高于空白对照组及空载体转染组(P<0.01)。MAD1过表达组含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA和蛋白相对表达量明显高于空白对照组及空载体转染组(P<0.05)。实验结果表明,MAD1过表达可通过抑制细胞增殖,激活细胞外凋亡途径和细胞内凋亡途径来促进人主动脉平滑肌细胞HA-VSMC细胞凋亡,参与主动脉夹层的发生与发展。

金龟子绿僵菌黏附素基因mad 1的敲除及功能分析

金龟子绿僵菌能够寄生昆虫,也能与植物共生。黏附素MAD1是绿僵菌与宿主互作初期的黏附因子。已知它在昆虫的侵染和致病中起重要作用,但与植物的互作机制报道甚少。为了研究MAD1在绿僵菌与植物共生中的作用,我们通过同源重组构建了金龟子绿僵菌mad 1敲除株,并检测了敲除株的生长、产孢、孢子萌发及毒力等生物学特性,进一步利用qRT-PCR分析了MAD1在调节花生免疫响应中的作用。结果显示,与野生型菌株相比,敲除株产孢量降低了43.67%,分生孢子萌发中时为27.69 h,显著长于野生型菌株的13.43 h。敲除株对家蚕的半致死时间LT 50为8.9 d,较野生型菌株的7.62 d显著延长。敲除株处理花生6 h后,花生免疫类基因CNGC 1、PCD 4,抗病基因SWEET 10及转录因子WRKY 41、MYB 86的转录水平出现显著上调,而钙调素CML 5、CML 19的转录表达受到明显抑制。本研究证明了mad 1是金龟子绿僵菌产孢、孢子萌发及毒力的正相关基因,并且MAD1在金龟子绿僵菌与植物相互作用初期,抑制植物抗性级联反应,减弱过敏反应,降低对微生物的抵御能力,同时增强共生信号的传导,这些作用有助于金龟子绿僵菌在花生根组织上定殖。

金龟子绿僵菌黏着蛋白MAD1原核表达及其抗体的制备

Mad1基因存在于金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae),在侵染昆虫表皮时起到了吸附性作用。为获得高纯度MAD1蛋白,制备多克隆抗体,以便深入了解其功能,本研究从金龟子绿僵菌中克隆出Mad1基因并连接到原核表达载体对其进行表达形式分析,经IPTG诱导及金属螯合层析纯化免疫家兔制备抗体,最后利用Western印记检测抗体特异性。经Western印记检测表明抗体特异性极高,诱导表达及纯化制备出高纯度MAD1蛋白产物,并获得效价为1∶12 800的多克隆抗体,为Mad1基因功能验证及分子检测提供良好的实验材料。