陕北胃癌高发区胃黏膜组织中MAD2的表达及意义

目的:研究MAD2在正常胃黏膜、胃病变黏膜组织中的表达,并探讨其与浅表性胃炎、萎缩性胃炎、不典型增生、胃癌之间的关系。方法:应用免疫组织化学SP法检测219例不同胃组织标本中MAD2的表达情况,所有标本均经病理证实。结果:MAD2在正常胃黏膜、浅表性胃炎、萎缩性胃炎、不典型增生、胃癌黏膜组织中的阳性表达率随病理学分类的不同而有差异。其中不典型增生、胃癌黏膜组织中MAD2的阳性表达率与其余各组MAD2的阳性表达率有明显的差异(P<0.05)。结论:胃病变组织中MAD2蛋白的异常高表达,对诊断不典型增生、胃癌有重要的参考意义。

细胞分裂调控基因MAD2与GFP融合的真核表达质粒的构建及表达

目的:构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中表达。方法:通过RT-PCR扩增,获得MAD2基因的完整序列。将此片断插入pEGFP-N1载体多克隆位点区,构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒。应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察表达的绿色荧光。结果:成功构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:该载体的成功构建,为研究MAD2基因在细胞分裂中的功能及定位建立了有效的观察体系。

绿僵菌mad2敲除株构建及其生物学和诱导植物响应的功能分析

【目的】昆虫病原真菌绿僵菌兼具植物内生性。已知黏附素MAD2是绿僵菌两种黏附蛋白之一,在实现绿僵菌与植物的黏附、定殖中起重要作用,但其作用机理知之甚少。本研究通过构建金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)mad2敲除突变株(Δmad2),探究MAD2蛋白对绿僵菌生物学功能的影响。【方法】从NCBI中获取mad2前后基因组DNA序列,设计扩增mad2前后同源臂特异性引物,以绿僵菌基因组DNA为模板,扩增得到前后同源臂基因S1、S2;设计特异性引物Hyg-F/R,以pKH-KO载体为模板,扩增得到带有启动子序列的潮霉素基因hyg;再通过overlap PCR构建mad2的同源敲除盒S1H、S2H;最后利用PEG介导的原生质体转化,获得稳定遗传的mad2敲除株。通过对比敲除株与野生株(WT)的生长特性、黏附作用、杀虫毒力以及诱导花生共生基因转录水平的变化,分析MAD2蛋白的生物学功能。【结果】原生质体转化获得了敲除mad2的同源重组转化子;敲除株与野生株对比分析表明,敲除株的孢子萌发率显著低于野生株,萌发中时间比野生株延长5.47 h;培养12 h和14 h时,敲除株的菌丝长度显著均小于野生株,分别为野生株的77.8%和76.3%;培养12 d的产孢量也比野生株减少33.3%。敲除株对洋葱内表皮的黏附力明显降低,但对蝗虫后翅的黏附性无显著影响。敲除mad2并不影响绿僵菌对家蚕的毒力。敲除株处理花生12 h后,与野生株处理相比,花生共生受体SYMRK、钙信号解码相关基因(CaM、CCaMK和DELLA)、脂质氮素转运相关基因(LTP1、NRT24、ABCC2)的转录水平出现显著下调;而与空白对照相比,mad2缺失后SYMRK转录水平仍有一定的上调,CaM、CCaMK和DELLA的转录水平产生显著抑制,对ABCC2、LTP1、NRT24的转录无明显影响。【结论】金龟子绿僵菌黏附素MAD2影响菌株的孢子萌发、早期菌丝生长、产孢及对植物的黏附力,但对昆虫的黏附和杀虫毒力无影响;在菌株与花生互作早期,MAD2触发了花生共生基因的转录。

EGFP-MAD2融合基因表达载体的构建及功能验证

目的:构建绿色荧光蛋白(EGFP)与有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(MAD2)融合基因表达载体,并初步验证融合基因的功能。方法:采用PCR技术扩增EGFP-MAD2融合基因,连接入T载体进行序列测定,随后克隆入逆转录表达载体p QCXIP-EGFP-N1获得重组质粒,采用脂质体转染293FT细胞,荧光显微镜观察融合蛋白的表达,流式细胞仪分析细胞周期。结果:获得序列正确的EGFP-MAD2融合基因及其表达载体p QCXIP-EGFP-MAD2;EGFP-MAD2基因可在293FT细胞中表达;流式分析显示EGFP-MAD2表达的细胞G2/M期比例增加。结论:构建了EGFP-MAD2融合基因表达载体,EGFP-MAD2融合蛋白的表达可以诱导细胞发生G2/M期阻滞。

双泛素与肿瘤关系的研究进展

双泛素属于泛素相关蛋白,由两个泛素样部分前后融合而成,是p53基因的一个下游靶点,与人纺锤体聚集检测点蛋白(MAD2)非共价结合导致染色体不稳定,与许多肿瘤的发生密切相关。以下仅就双泛素的结构、分子生物学功能及其与p53基因、MAD2蛋白和肿瘤发生的关系作一综述,为肿瘤的发生及治疗开辟新的思路。

siRNA干扰Mad2蛋白的表达对乳腺癌MCF-7细胞紫杉醇药物敏感性的影响

目的研究纺锤体检测点蛋白Mad2对乳腺癌细胞MCF-7紫杉醇敏感性的影响。方法运用小片段干扰RNA技术下调MCF-7细胞中Mad2蛋白的表达，经不同浓度的紫杉醇药物浓度处理，通过细胞术检测细胞周期分布，MTY法检测细胞存活率的变化，RT—PCR及Western印迹法检测相关蛋白的表达改变情况。结果siRNA可以特异性干扰MCF-7细胞中Mad2蛋白水平的表达，同时显著降低紫杉醇诱导细胞发生有丝分裂阻滞的比例，导致CyclinB1的表达下调，凋亡率降低；并且Mad2表达下调后，MCF-7细胞中黏附分子E-cadherin的表达量也降低。结论Mad2在紫杉醇诱导MCF-7细胞发生有丝分裂周期阻滞中发挥重要作用，进而影响细胞对紫杉醇的敏感性，同时细胞黏附分子E—cadherin可能参与这一过程的发生。