人工合成家蝇抗真菌肽MAF-1A对白色念珠菌致病性的影响

目的观察和研究人工合成家蝇抗真菌肽MAF-1A对白色念珠菌致病性的影响。方法以白色念珠菌ATCC10231为效应菌,检测MAF-1A在MIC浓度下不同时间白色念珠菌的孢子萌发率及芽管形成率,瑞氏染色后显微镜计数,观察MAF-1A预处理后及干预下,酵母相和菌丝相白色念珠菌定植人口腔黏膜上皮细胞能力变化;分别设立氟康唑(fluconazole,FLC)和PBS为阳性对照和阴性对照。结果 MAF-1A作用白色念珠菌后,孢子萌发率及芽管形成率小于阳性对照和阴性对照组(P<0.05);MAF-1A可减少白色念珠菌酵母相细胞或菌丝相细胞对人口腔黏膜上皮细胞的粘附数,且减少酵母相细胞粘附作用强于菌丝相细胞(P<0.05);MAF-1A预处理白色念珠菌后,对人口腔黏膜上皮细胞粘附数少于MAF-1A干预组的细胞粘附数(P<0.05)。结论 MAF-1A可通过抑制白色念珠菌孢子萌发和芽管的形成以及有效降低白色念珠菌对人口腔黏膜上皮细胞粘附能力,从而影响白色念珠菌的致病能力。

抗菌肽MAF-1A洐生肽的设计及其抗白色念珠菌活性

目的探讨家蝇抗真菌肽-1A(MAF-1A)衍生肽的设计及其抗白色念珠菌(C.albicans)活性。方法采用序列截短及氨基酸残基替换法设计4条MAF-1A衍生肽,生物信息学分析其理化特性;取对数生长期C.albicans ATCC10231制备成浓度为(0.5~2.5)×10^(6)cfu/L的菌液,采用微量稀释法检测4条衍生肽对C.albicans的抗菌活性,另设MAF-1A组(25~1600 mg/L MAF-1A处理)、氟康唑(FLC)对照组(0.25~64.00 mg/L FLC处理);采集健康人全血,离心取血细胞制作重悬红细胞,与不同终浓度(25~400 mg/L)活性衍生肽混匀,分为MAF-1A组、MAF-1A22S3组、MAF-1A20S3组、MAF-1A18S5组、MAF-1A16S5组、阳性对照(0.1%Triton X-l00处理)及阴性对照组[磷酸盐缓冲溶液(PBS)处理],采用体外溶血实验检测各组红细胞的溶血率;制备(1.0~5.0)×10^(9)cfu/L菌液,与不同终浓度[1、2、4×最小抑菌浓度(MIC)]活性衍生肽稀释液混合,设MAF-1A组(1、2、4×MIC MAF-1A处理)和FLC(1、2、4×MIC FLC处理)对照组,分别于0、4、8、12、16、20及24 h取混合菌液100μL于沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)平板上37℃培养,记录菌落数,绘制时间-杀菌曲线检测MAF-1A、MAF-1A22S3及FLC对C.albicans的杀菌动力学;制备1.0×10^(9)cfu/L C.albicans菌液,加不同终浓度(1、2、4×MIC)的活性衍生肽稀释液,设MAF-1A(1×MIC MAF-1A处理)、FLC(1×MIC FLC处理)对照组和阴性对照组(PBS处理),采用扫描电镜观察各组C.albicans的形态学改变。结果4条衍生肽对C.albicans均具有抗菌活性,MIC和MFC值均较模板肽MAF-1A降低,其中MAF-1A22S3的抗菌活性增加最为明显;衍生肽MAF-1A22S3、MAF-1A20S3溶血活性低于模板MAF-1A,其中MAF-1A22S3的溶血性最低(6×MIC范围内溶血率<5%);MAF-1A22S3对C.albicans具有较强的杀菌作用、且呈浓度依赖性,同浓度时杀菌效率强于模板肽MAF-1A和FLC对照组;衍生肽MAF-1A22S3作用后C.albicans细胞表面出现明显的凹陷、裂痕、胞质外溢、细胞皱缩及裂解死亡等病理改变,且细胞损伤程度与衍生肽浓度呈正相关。结论衍生肽MAF-1A22S3体外抗真菌效果明显,且体外溶血性低,其机制可能与破坏菌细胞的完整性有关。

抗真菌肽MAF-1A体外对近平滑念珠菌生物膜形成能力的影响、与生物膜结合及抑菌情况观察

目的观察不同浓度抗真菌肽MAF-1A处理的近平滑念珠菌F1356生物膜形成能力及生物膜细胞活性。方法取F1356菌体适量分5份,其中4份分别加入终浓度为0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL的MAF-1A,等量无菌水处理为空白对照,另取适量F1356分5份,其中4份分别加入0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL的氟康唑(FLC),设置无菌水处理为空白对照,经培养24 h时观察F1356生物膜形成能力(OD490nm值),倒置显微镜下观察F1356生物膜中的菌体密度及膜致密结构。体外培养F1356使其形成生物膜结构,加入0.6 mg/mL的FITC-MAF-1A培养,分别于培养1、3、6、12、24 h采用荧光标记技术观察MAF-1A与F1356生物膜结合情况。将F1356菌体分为5份,其中4份分别加入终浓度分别为0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL的MAF-1A,加入无菌水者为空白对照,培养24 h后通过XTT细胞活性检测技术检测F1356生物膜细胞活性(OD450nm值)。结果与空白对照比较,0.6、0.9、1.2 mg/mL的MAF-1A处理的F1356生物膜形成能力降低(P≤0.05),镜下可见F1356生物膜中菌体密度减少,膜致密结构被破坏;与空白对照比较,0.6、0.9、1.2 mg/mL的FLC处理后F1356生物膜形成能力降低(P≤0.05),镜下可见0.6、0.9、1.2 mg/mL的FLC处理的F1356生物膜中菌体密度减少,膜致密结构被破坏。随培养时间延长,镜下可见黄绿色荧光信号逐渐增多,培养24 h时可观察到生物膜内细胞存在大量黄绿色荧光信号。随MAF-1A浓度增加,F1356生物膜细胞活性逐渐降低(P均≤0.05)。与对照组比较,0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL FLC处理的F1356生物膜活性降低(P均≤0.05),与0.3 mg/mL FLC比较,0.9、1.2 mg/mL FLC处理的F1356生物膜活性升高(P均≤0.05)。结论MAF-1A可抑制F1356的生物膜形成,且MAF-1A可与F1356生物膜结合进入生物膜细胞内聚集,2MIC浓度(0.6 mg/mL)即可抑制F1356生物膜的细胞活性。

家蝇抗菌肽MAF-1A体外抗甲型流感病毒活性及机制研究

目的探讨家蝇抗菌肽MAF-1A体外抗甲型流感病毒(IAV)活性及其潜在机制。方法通过观察CPE、MTT法及qRT-PCR评价MAF-1A体外抗IAV活性,采用MTT法测定MAF-1A对MDCK细胞的毒性;利用透射电镜(TEM)技术、血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验进一步分析MAF-1A抗IAV的作用机制。结果MAF-1A对IAV的半数有效浓度(EC50)为(89.8±2.97)μg/mL,而对MDCK细胞的毒性较小;MAF-1A可直接破坏IAV形态结构的完整性;浓度为1.56μg/mL的MAF-1A即可抑制IAV引起的红细胞凝集;对神经氨酸酶具有抑制作用,IC50为(134.7±10.31)μg/mL。结论抗菌肽MAF-1A具有体外抗IAV活性,除能直接破坏IAV的结构外,还可能通过与血凝素HA1亚基结合、抑制神经氨酸酶的活性而阻止IAV的感染,提示MAF-1A具有多靶点抗IAV的作用。

家蝇抗菌肽MAF-1A的串联表达与抗白念珠菌体外活性检测

目的构建家蝇抗菌肽MAF-1A基因原核串联表达体系,在大肠杆菌中表达具有抗菌活性的MAF-1A。方法根据大肠杆菌密码子的偏嗜性进行密码子优化,设计并合成含有5个拷贝的MAF-1A串联基因序列;将合成的串联基因序列克隆到表达载体pET28a并转化大肠杆菌Roseeta(DE3),应用IPTG诱导表达5×MAF-1A串联重组蛋白;通过SDS-PAGE电泳、Western Blot对表达产物进行分析;用肠激酶专一性切割经Ni-NTA纯化后的5×MAF-1A重组串联蛋白,得到MAF-1A单体;采用微量稀释法检测MAF-1A单体对白念珠菌的体外抗菌活性。结果 5×MAF-1A蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达,28℃、0.8mmol/L IPTG诱导12h可达最大表达量;酶切后的抗菌肽MAF-1A单体对白念珠菌的MIC和MBC分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL。结论成功构建MAF-1A原核串联表达系统,重组表达的MAF-1A对白念珠菌具有较高的抑杀活性。

人工合成家蝇抗真菌肽MAF-1A体外抗真菌效果及扫描电镜观察

目的探讨人工合成家蝇抗真菌肽MAF-1A结构特点及其抗真菌效果。方法运用生物信息学软件分析人工合成MAF-1A的结构特征;采用液体微量稀释法、MTT法和沙氏琼脂平板培养计数法分别检测MAF-1A对白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌和新生隐球菌的抗菌活性及最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),并绘制时间-杀菌曲线;采用扫描电镜观察在MIC浓度下对白色念珠菌超微结构的影响。结果生物信息学软件分析结果显示MAF-1A为一阳离子多肽,分子量3022.5Da,pI值9.23,碱性氨基酸含量26.9%,带2个正电荷,结构较为稳定,脂肪指数71.54,其总平均疏水性数-1.081,预测为一非跨膜多肽,二级结构以α螺旋结构为主的线状肽结构。MAF-1A对白色念珠菌敏感株及耐药株均显示出抗菌活性,对检测酵母菌的MIC值在0.1~0.8mg/ml、MBC值在0.2~0.9mg/ml;杀菌曲线显示,MIC浓度MAF-1A作用真菌2h至14h逐渐发挥杀菌活性。扫描电镜显示MAF-1A作用白色念珠菌后形态发生改变,菌体表面粗糙,可见细胞穿孔样变,严重病变细胞表面呈碎片状,刺状突起,胞质流失至细胞皱缩死亡。结论 MAF-1A为阳离子α-螺旋结构线性多肽,对常见的致病性念珠菌包括耐药性菌株具有抗菌活性,可通过破坏真菌细胞表面结构发挥杀菌作用。

家蝇幼虫血淋巴抗真菌肽MAF-1的分子特性分析及其抗真菌作用

制备家蝇Musca domestica幼虫血淋巴中的抗真菌肽,对其分子特性及抗真菌机制进行研究。通过C18柱固相萃取、反相高效液相色谱相结合的方法,成功制备到家蝇幼虫血淋巴抗真菌肽MAF-1。SDS-PAGE分析结果表明,MAF-1的分子量为17.136kDa。通过圆二色谱测出水溶液中MAF-1主要以α螺旋及β折叠为主。扫描电镜观察结果显示,MAF-1作用白假丝酵母菌Candida albicans1h后,部分真菌出现表面凸凹不平,细胞结构模糊;随着作用时间的延长,表面形成很明显的凹陷,皱缩,个别菌体破裂,内容物外泄,病变真菌发生率高于对照组。单细胞凝胶电泳(single-cell gel electrophoresis,SCGE)结果显示,正常对照组的真菌呈现典型的圆形,而实验组则出现明显的拖尾现象即形成"彗星"样细胞特征,细胞迁移距离明显高于对照组。SDS-PAGE图谱显示,MAF-1作用后的白假丝酵母菌菌体蛋白谱带一些条带明显变浅,条带数下降,甚至消失。结果提示MAF-1可能具有独特的抗真菌机制。

家蝇抗真菌肽-1A对人肝癌细胞HepG2的影响

目的探讨家蝇抗真菌肽-1A(MAF-1A)对人肝癌细胞Hep G2的作用。方法取人肝癌细胞Hep G2和人正常肝细胞LO2进行传代培养;采用原核串联表达及镍柱亲和层析法制备MAF-1A,采用显微观察法检测0、50及100 mg/L MAF-1A作用Hep G2细胞24 h后的细胞形态变化,采用噻唑蓝(MTT)法检测0、25、50、100、200、400及800 mg/L MAF-1A分别作用于Hep G2和LO2细胞24 h后的细胞生存率,采用乳酸脱氢酶(LDH)释放试验检测0、25、50、100、200及400 mg/L MAF-1A作用Hep G2细胞24 h后对细胞的破坏性,采用细胞划痕愈合试验检测0、100及200 mg/L MAF-1A作用Hep G2细胞12和24 h后细胞迁移能力的变化;用磷酸盐缓冲液(PBS)将抗凝的人红细胞浓度调节为1%体积分数,以1%Triton X-100为阳性对照组,PBS为阴性对照组,采用红细胞体外溶解试验检测100、200、400、800、1200、1 800及2 400 mg/L MAF-1A作用人红细胞1 h后的溶血活性。结果 MAF-1A作用24 h后,镜下可见Hep G2细胞出现表面皱褶、坏死脱落等细胞病变效应(CPE),且浓度越高、CPE越明显;与0 mg/L组比较,各浓度组MAF-1A均对Hep G2细胞有抑制作用(P<0.05或P<0.01),并呈浓度依赖性,但对LO2细胞的抑制作用不明显;MAF-1A使细胞释放LDH的量增多,且LDH释放率随着MAF-1A浓度的升高而增大(P<0.01);各浓度组MAF-1A均能抑制Hep G2细胞的迁移运动,高浓度组抑制作用更为明显(P<0.05);MAF-1A浓度达2 400 mg/L时,溶血率<1%。结论 MAF-1A能抑制Hep G2细胞的增殖及迁移,但对人正常肝细胞LO2和红细胞无明显毒性作用。

家蝇抗真菌肽-1A对人肝癌细胞HepG2抑制作用的机制

目的探究家蝇抗真菌肽-1A (MAF-1A)对人肝癌细胞Hep G2抑制作用的机制。方法采用原核串联表达及镍柱亲和层析法制备MAF-1A;取人肝癌细胞Hep G2进行传代培养,采用透射电镜技术,观察不同浓度MAF-1A(0、50、100 mg/L)作用细胞Hep G2细胞24 h后对细胞超微结构的影响;采用流式细胞术检测MAF-1A(0、100、200及400 mg/L)作用Hep G2细胞24 h后的细胞周期、细胞内ROS水平及细胞凋亡率;以荧光探针法检测MAF-1A(0、100、200及400 mg/L)作用Hep G2细胞24 h后的线粒体膜电位。结果透射电镜结果显示,MAF-1A作用后Hep G2细胞出现染色质边集,核固缩,胞膜出芽、空泡化、形成凋亡小体等形态学变化;流式细胞术检测结果显示,与0 mg/L MAF-1A组比较,MAF-1A各浓度组均可使G0/G1期的细胞比例升高(P<0.01),细胞凋亡率明显增高(P<0.01),当MAF-1A浓度达400 mg/L时、细胞内活性氧(ROS)含量明显增多(P<0.01);荧光探针检测发现,与0 mg/L MAF-1A组比较,MAF-1A可使Hep G2细胞的线粒体膜电位显著下降,并且随着MAF-1A浓度的升高,线粒体膜电位下降细胞数的占比增高。结论 MAF-1A可能通过促进线粒体膜电位下调、增加细胞内ROS含量所介导的细胞凋亡,以及阻滞细胞周期来发挥抑制Hep G2细胞的作用。

家蝇抗真菌肽-1A体外抗白念珠菌的细胞内作用机制

目的探讨家蝇抗真菌肽-1A(MAF-1A)体外抗白念珠菌(C.albicans)的细胞内作用机制。方法取C.albicans冻存物划线接种、培养并制备浓度为2×10^(9) cfu/L的菌悬液;分别以0、625、1250及2500 mg/L的MAF-1A作用24 h,采用荧光指示剂法检测各处理细胞内活性氧(ROS)含量的变化;取0、781及1560 mg/L抗氧化剂维生素C(V_(c))和还原型谷胱甘肽(GSH))预处理C.albicans细胞30 min,采用微量稀释法检测MAF-1A抗C.albicans的最小抑菌浓度(MIC);采用荧光指示剂法检测0、625、1250及2500 mg/L的MAF-1A作用24 h后C.albicans细胞线粒体膜电位的变化;取C.albicans脱氧核糖核酸(DNA)与等体积不同浓度(0、625、1250及2500 mg/L)MAF-1A共孵育6 h,采用琼脂糖凝胶阻滞实验分析MAF-1A对C.albicans DNA的影响。结果与0 mg/L MAF-1A相比,不同浓度MAF-1A处理C.albicans细胞内ROS量明显增加(P<0.01),且胞内ROS的含量随着MAF-1A处理浓度的增加而增加,呈剂量依赖性;V C和GSH处理后,MAF-1A抗C.albicans的MIC值由625 mg/L升高至1250 mg/L;MAF-1A处理后,C.albicans细胞线粒体的膜电位未出现变化(P>0.05);凝胶阻滞实验结果显示,不同浓度MAF-1A与C.albicans DNA孵育后,DNA条带出现滞后及变暗淡现象,且在加样孔有滞留,这种阻滞现象随着MAF-1A浓度升高越明显。结论MAF-1A不仅能诱导C.albicans细胞内大量产生ROS,还能通过与DNA的结合而发挥对C.albicans的抑制作用。

抗真菌肽-1A对白念珠菌细胞膜的作用

目的探讨抗真菌肽-1A(MAF-1A)对白念珠菌(Candida albicans)细胞膜的作用机制。方法取C.albicans冻存物划线接种、培养并制备成浓度为2×109 cfu/L的菌悬液;分别以0、625、1250及2500 mg/L的MAF-1A作用12 h,采用荧光探针法及激光共聚焦扫描显微技术观察MAF-1A对C.albicans细胞膜完整性和通透性的影响;以0和1250 mg/L的MAF-1A分别作用细胞24 h,通过qPCR技术检测MAF-1A对C.albicans细胞膜麦角甾醇合成相关基因(ERG1、ERG6、ERG5、MET6)mRNA表达水平的影响。结果与对照组(MAF-1A为0)相比,不同浓度MAF-1A作用C.albicans 12 h之后,荧光染料PI可透过细胞膜进入到胞质内,C.albicans细胞膜的通透性增加,且细胞膜通透性随MAF-1A作用浓度的升高而增加,呈剂量依赖性;qPCR结果显示,MAF-1A可使C.albicans麦角甾醇合成相关基因ERG1、ERG6、ERG5、MET6的mRNA表达水平下调(P<0.05)。结论MAF-1A可增加C.albicans细胞膜通透性,其机制可能与抑制细胞膜麦角甾醇合成相关基因mRNA的表达有关。

家蝇抗真菌肽MAF-1原核表达条件优化及活性验证

目的优化家蝇抗真菌肽(MAF-1)原核表达条件及重组蛋白的活性验证。方法利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Quantity One凝胶电泳图像分析系统研究不同的诱导温度、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度和诱导时间对融合蛋白表达的影响;融合蛋白用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行蛋白纯化,切除His标签后进行活性验证。结果在加入浓度为25μmol/L的IPTG,34℃诱导18 h,融合蛋白的表达量最高;融合蛋白纯化后浓度为0.706 mg/m L,其最低抑杀白色念珠菌的浓度为70μg/m L。结论成功获得重组融合蛋白的最佳表达条件,并纯化目的蛋白,切除His标签后的目的蛋白具有抗真菌活性。

家蝇抗菌肽基因MAF-1的表达模式及响应微生物刺激分析

Musca domestica antifungal peptide-1(MAF-1)是家蝇体(Musca domestica)内组成型表达的一种独特且具有良好抑菌效果的抗真菌肽。本研究利用实时荧光定量PCR技术分析MAF-1在家蝇不同发育时期、不同组织器官及家蝇3龄幼虫经微生物(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌)刺激后的表达特征。结果显示,MAF-1在家蝇各个发育时期的相对表达量依次为:2龄幼虫>1龄幼虫>3龄幼虫>雄蝇成虫>卵>雌蝇成虫>蛹;MAF-1在家蝇3龄幼虫各组织器官的相对表达量依次为:脂肪体>唾液腺>气管>肠道>体壁。通过超微量显微注射法向家蝇3龄幼虫体内注入病原微生物,其中金黄色葡萄球菌刺激后MAF-1的表达量呈下降趋势;大肠杆菌刺激后MAF-1的表达量先降低后升高再降低;白色念珠菌刺激后MAF-1的表达量先升高然后逐渐下降。本研究从RNA水平上说明了MAF-1的表达随着家蝇幼虫的生长发育阶段变化,对不同微生物刺激的响应具有不同的特征。同时MAF-1还是家蝇抵抗病原微生物感染的重要天然免疫分子,这为进一步研究其参与家蝇天然免疫防御过程提供了基础。