黑色素瘤相关抗原MAGE-E1 mRNA在胶质瘤中的定量表达研究

目的:了解MAGE-E1 mRNA在胶质瘤中的表达,探讨将它用于胶质瘤免疫治疗的可能性。方法:建立实时定量PCR方法,检测47例人胶质瘤及14例正常脑组织中MAGE-E1,管家基因HPRT1作为内参,以MAGE-E1/HPRT1值计算MAGE-E1 mRNA表达量,并对MAGE-E1 mRNA表达与临床指标的关系进行分析。结果:在正常脑组织及胶质瘤中,MAGEE1高度表达率分别为7.1%和66.0%,两者比较具有统计学差异(P<0.05)。MAGE-E1 mRNA的表达与病人性别、年龄、病理类型和级别无关。结论:MAGE-E1 mRNA在胶质瘤中水平较高,提示MAGE-E1可能成为胶质瘤免疫治疗的候选靶抗原。

睾丸肿瘤抗原MAGE-E1基因片段的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :克隆及表达人胶质瘤特异性抗原MAGE E1基因片段。方法 :从人胶质瘤细胞系BT 32 5提取总RNA ,用RT PCR从中扩增出MAGE E1基因片段。将MAGE E1基因片段插入载体pGEM Teasy中 ,经全自动序列分析仪测序正确后 ,再克隆至表达载体 pGEX 4T 2中 ,构建重组表达载体pGEX 4T 2 MAGE E1,并转化大肠杆菌进行表达。结果 :用 1mmol/L异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导 5h ,MAGE E1蛋白的表达即达高峰。SDS PAGE及凝胶密度扫描分析表明 ,表达出Mr 约 4 10 0 0大小的蛋白 ,占菌体总蛋白的 35 %。结论 :该基因片段的高效表达为进一步制备其抗体 ,以及制备肿瘤疫苗奠定了基础。

人睾丸肿瘤抗原MAGE-E1基因的克隆测序及在原核系统中的表达

目的 扩增及克隆人的MAGE E1基因并利用大肠杆菌进行表达。方法 从人胶质瘤细胞系BT 32 5中提取总RNA ,用RT PCR从中扩增出MAGE E1基因片段。将MAGE E1基因片段插入载体pGEM Teasy中 ,经全自动序列分析仪测序正确后 ,再克隆至表达载体pGEX 4T 2中 ,构建重组表达载体 pGEX 4T 2 MAGE E1,并转化大肠杆菌进行表达。 结果 1mmol/L异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导 5h ,MAGE E1蛋白表达即达高峰 ,SDS PAGE及凝胶密度扫描分析表明 ,表达出Mr约 4 10 0 0大小的蛋白 ,占菌体总蛋白的 35 %。结论 成功扩增、克隆MAGE E1基因 ,并在大肠杆菌中得到稳定高效表达。

人黑色素瘤抗原MAGE-3基因的克隆与表达

目的克隆人黑色素瘤特异抗原 MAGE- 3基因 ,以制备肿瘤 DNA疫苗。方法用 RT- PCR方法制备 MAGE-3基因 ,以哺乳细胞高效表达质粒 p CI- neo为载体 ,构建重组 DNA疫苗。重组体用载体上的通用引物为测序引物 ,鉴定克隆的正确性。再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化 2 93细胞 ,用免疫印迹法鉴定转化细胞中 MAGE- 3基因的表达。结果正确构建了 MAGE- 3/p CI- neo重组质粒 ,并且在转化细胞中检测出了 MAGE- 3的表达。结论成功地构建了重组 MAGE- 3/p CI- neo肿瘤核酸疫苗 。

MAGE-1、MAGE-3基因在胃癌和胃活检组织中的表达及意义

目的 :检测黑色素瘤抗原基因 1、 3(MAGE 1和MAGE 3)在胃癌中的表达 ,探索其在胃癌免疫治疗中的应用价值。方法 :采用RT PCR法 ,对 36例胃癌患者的癌组织和相应的癌旁“正常”黏膜 ,以及 37例慢性胃炎患者的胃镜活检组织中 ,MAGE 1和MAGE 3基因的表达进行研究 ,并对RT PCR扩增产物中的目的基因片段进行DNA测序验证。结果 :36例胃癌组织中 ,MAGE 1基因的表达阳性率为 72 .2 2 % (2 6 / 36 ) ,MAGE 3基因的表达阳性率为 6 9.4 4 % (2 5 / 36 )。MAGE 1、MAGE 3的表达均为阳性者为 5 2 .78% (19/ 36 )。癌旁“正常”黏膜中 ,MAGE 1、MAGE 3基因的表达阳性率分别为 4 7.2 2 % (17/ 36 )和4 4 .4 4 % (16 / 36 ) ;MAGE 1、MAGE 3基因表达双阳性者为 30 .5 5 % (11/ 36 )。在 37例胃慢性炎症患者中 ,MAGE 1、MAGE 3基因的表达阳性率 ,分别为 2 9.73% (11/ 37)和 2 7.0 3% (10 /37) ;MAGE 1、MAGE 3基因的表达双阳性者为 8.1% (3/ 37)。胃癌组织中 ,MAGE 1和MAGE 3基因表达阳性率均高于癌旁和胃慢性炎症患者 ;在肿瘤组织中的表达阳性率与肿瘤浸润的深度和分化程度有关 (P <0 .0 5 ) ;而与临床病理分期及淋巴结转移无关 (P >0 .0 5 )。结论 :基于MAGE 1和MAGE 3基因在胃癌中的高表达率 ,可利用这两种蛋白作为靶?

肿瘤抗原MAGE-12的表位及二级结构预测

目的预测肿瘤抗原 MAGE- 12的α-螺旋二级结构、B细胞表位和 MAGE- 12的 HL A- A2限制性 CTL表位。方法用 Garnier- Robson和 Chou- Fasman方案预测肿瘤抗原 MAGE- 12的α-螺旋二级结构 ;用 Kyte- Doolittle亲水方案预测肿瘤抗原 MAGE- 12的 B细胞表位 ;用简单基序 ( simple motifs)和延展基序 ( extended m otifs)对肿瘤抗原 MAGE- 12的 HL A-A2限制性 CTL 表位进行预测。结果 MAGE- 12可能含有较多的 α-螺旋 ;B细胞识别的表位可能在 82～ 93残基 ( QSDEGSS-NEEQE)或附近和 3～ 14残基 ( L EQRSQHCKPEE)或附近 ;发现 1个 HL A- A2限制性 CTL 表位为 FL WGPRAL V( 2 71～2 79)。结论用亲水性方案和基序法预测肿瘤抗原 MAGE- 12的 B细胞表位和 MAGE- 12的 HL A- A2限制性 CTL 表位 ,为实验方法探索 MAGE- 12的表位提供有用线索。

肿瘤抗原MAGE-12的B细胞表位4分支多重抗原肽的合成及鉴定

目的 设计合成肿瘤抗原MAGE 12的B细胞表位抗原肽并对其进行鉴定。方法 在预测MAGE 12的B细胞表位序列为QSDEGSSNEEQE(82 -93 )的基础上 ,采用 4分支多重抗原肽结构合成抗原肽 ,免疫C 5 7BL 6小鼠 ,产生多克隆抗体 ,应用ELISA实验及免疫组化实验检测多克隆抗体是否为人的抗原肽的特异性抗体。结果 免疫C 5 7BL 6小鼠后可产生MAGE 12的抗原特异性的多克隆抗体 ,抗体滴度可达 1∶64。结论 证明所预测的表位为MAGE 12的B细胞表位。

一个新的MAGE-1表位为肝癌细胞表面HLA-B7分子递呈

目的 :肿瘤抗原的存在是机体识别肿瘤并激活免疫系统的物质基础 ,机体抗肿瘤免疫以细胞免疫为主 ,故寻找被T细胞识别的肝癌细胞抗原肽 ,为肝癌免疫治疗奠定基础。方法 :对于肝癌细胞系HHCC(HLA A2 ,A2 9,B7,B5 1) ,应用细胞膜酸洗技术使抗原肽从细胞膜表面脱落 ,经过凝胶层析 ,反相高效液相色谱层析得到不同组份多肽 ,高效液相色谱 质谱仪联用技术获得抗原肽的一级结构 ,通过氨基酸锚定位点分析 ,预测其HLA配体类型 ;互联网上氨基酸同源性分析确定其同源性序列 ;人工合成抗原肽 ,HLA同型树突状细胞递呈合成抗原肽刺激特异性CTL反应 ,51Cr杀伤实验检测CTL对肿瘤细胞系的杀伤作用。结果 :经过反相高效液相色谱层析后可以获得 10多个组份 ,其中一个组份经过液质联用鉴定和氨基酸同源性分析确定其序列为EPVTKAEML ,是黑色素瘤抗原 1,MAGE 1(12 1 12 9)表位 ,由HLA B7分子递呈 ,体外诱导实验表明其可以诱导出较强的CTL反应。结论 :液质联用技术是寻找抗原肽的有效方法 ,MAGE 1抗原肽EPVTKAEML对于HLA B7阳性及MAGE

黑色素瘤抗原基因MAGE-1、MAGE-3和抑癌基因p53在肺癌中表达的研究

目的:分析肺癌组织MAGE-1和MAGE-3基因以及p53基因表达及其相互关系。方法:取肺癌组织标本30例,另取癌周组织作为对照。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测MAGE-1和MAGE-3基因以及p53基因的表达。结果:MAGE-1,MAGE-3在肺癌中有较高表达,MAGE-3的表达高于MAGE-1的表达。p53在肺癌中表达较低,在正常组织中表达较高;MAGE-1在肺腺癌中表达较鳞癌高,MAGE-3在肺鳞癌中表达较高;MAGE-1,MAGE-3的表达可能与肿瘤分化程度无关;p53在小细胞肺癌中的表达有待进一步研究;p53与MAGE在体内表达成负相关。结论:MAGE-1、MAGE-3和p53在肺癌组织与正常组织中有不同的表达,MAGE-1、MAGE-3的表达与病理类型有关,与肿瘤分化无关。

MAGE-3基因的表达检测和重组MAGE抗原的制备及其应用

目的克隆MAGE-3基因并检测其在人食管癌组织中的表达情况；重组表达MAGE-1和MAGE-3抗原，用于食管癌的治疗性蛋白疫苗的免疫原性研究。方法RT-PCR法检测了MAGE-3在人食管癌组织中的表达情况。采 用DNA重组技术将MAGE-1和MAGE-3全长cDNA 克隆至pET30a(+)载体上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，经SDS-PAGE 和 wes-tern blot鉴定后，制备其可溶性蛋白，研究其对人T细胞增殖能力的影响。结果MAGE-3基因 在食管癌组织中的表达率为50%（15/30）；在30例相应癌旁正常组织中未见表达。成功获得了MAGE-1和MAGE-3可溶性蛋白；人 T细胞能够对自身抗原递呈细胞加工处理的MAGE-1和MAGE-3蛋白产生应答。结论MAGE-1和MAGE-3蛋白可能是用于食管癌免疫治疗的免疫原性较强的靶抗原。

MAGE-1与IL-18共表达DNA疫苗的构建与体外表达

目的构建MAGE-1与IL-18共表达质粒pcIL-18-MAGE并进行体外验证表达。方法设计合成MAGE-1与IL-18引物,PCR扩增其基因片段,分别构建以pcDNA3为载体的小鼠IL-18重组质粒和人MAGE-1重组质粒,pcCMV-IL-18与MAGE-1的PCR产物酶切连接构建共表达质粒pcIL-18-MAGE。脂质体法将构建的重组质粒转染293细胞,RT-PCR和Western印迹法验证MAGE-1和IL-18在转化细胞中的表达。结果成功获得共表达质粒pcIL-18-MAGE,RT-PCR可见目的条带,Western印迹显示转染MAGE-1与IL-18的细胞在蛋白质水平上均有表达。结论成功地构建出既表达mIL-18又表达MAGE-1的共表达质粒pcIL-18-MAGE。

MAGE-1基因在人食管癌中的表达及基因克隆

目的研究 MAGE- 1基因在人食管癌中的表达 ,分析 MAGE- 1抗原能否作为食管癌的治疗性候选疫苗。方法采用 RT- PCR方法检测了 MAGE- 1基因在 30例食管癌组织和相应癌旁正常组织中的表达 ;并从食管癌组织中扩增了 MAGE-1c DNA全长序列 ,经酶切后与 p ET- 30 a(+ )质粒载体连接 ,经初步酶切鉴定后 ,进行 DNA序列分析 ,获得克隆基因的核苷酸序列。结果 MAGE- 1基因在食管癌组织中的表达率为 43% (13/30 ) ,在 30例相应癌旁正常组织中未见表达 ;成功地克隆了MAGE- 1c DNA全长序列。结论由于 MAGE- 1基因在食管癌中高频率表达以及 MAGE- 1抗原具有 HL A- I类分子限制性CTL 识别表位 ,因此 ,MAGE-

MAGE-3 DNA疫苗的构建及其免疫效果的观察

通过RT PCR方法扩增MAGE 3cDNA ,以pcDNA3 1+为载体 ,构建重组表达质粒pcDNA3 1 MAGE 3。重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞 ,经RT PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE 3的表达。以 10 0 μg质粒剂量肌肉注射接种小鼠 ,间隔 10天 ,共 3次 ,以空载体和PBS为对照。结果 ,重组质粒免疫的小鼠 ,其脾淋巴细胞对MAGE 3阳性靶细胞的杀伤活性为 51 0 8± 7 41% ,与空载体组 (8 44± 1 89% )及PBS组 (5 76± 1 75% )相比 ,差异有显著性 (P <0 0 1) ,而对MAGE 3阴性靶细胞的杀伤活性分别为 8 2 1± 1 65% ,7 68± 1 56%和 5 13±1 42 % ,其差异无显著性 ;MAGE 3DNA疫苗组免疫血清 1∶15稀释时能检测到抗MAGE 3抗体 ,脾细胞培养上清中Th1类细胞因子IFN γ、IL 2水平明显升高 ,外周血中CD4+、CD8+T细胞也提高 ,小鼠肿瘤的生长速度明显减慢 ,与对照组相比 ,差异显著 (P <0 0 1)。说明MAGE

CpG增强DC疫苗对黑色素瘤B16-HLA-MAGE-3的免疫效果

目的:观察CpG对抗原肽负载DC疫苗免疫效果的增强作用。方法:分别用50μg/ml的MAGE-3271-279抗原肽、4μg/ml的CpG和MAGE-3271-279抗原肽(50μg/ml)+CpG(4μg/ml)刺激培养到第6天的小鼠骨髓DC细胞,2天后用LPS再刺激24小时诱导其成熟;给HLA-A*0201/Kb转基因鼠移植B16-HLA-MAGE-3黑色素瘤,并于小鼠荷瘤的第-4、5和8天分别于颈部皮下注射同系小鼠DC疫苗(2×105/鼠),观察荷瘤鼠肿瘤生长情况;在荷瘤的第23天处死小鼠,检测脾脏NK细胞活性。给正常HLA-A2转基因小鼠皮下注射DC疫苗,8周后接种肿瘤细胞,观察免疫记忆形成情况。结果:抗原肽负载的DC疫苗,在小鼠荷瘤的第14天之前,小鼠肿瘤生长受到抑制,在第15天后抑瘤作用不明显;CpG与MAGE-3271-279+CpG负载的DC疫苗可显著抑制荷瘤鼠肿瘤的生长,且可诱导较高的NK细胞活性。MAGE-3271-279+CpG负载的DC疫苗在免疫8周后依然可抑制肿瘤细胞的生长,说明可以诱导免疫记忆形成。结论:CpG对抗原肽负载的DC疫苗的免疫效果具有潜在的增强作用。

MAGE-1 MAGE-3及AFP基因在肝癌组织中的表达

目的:探讨MAGE-1、MAGE-3和AFP mRNA在肝癌组织中的表达及用于检测微小转移的可能性。方法:应用聚合酶链反应(PCR)检测86例原发性肝癌患者肝癌组织中MAGE-1、MAGE-3和AFP mRNA的表达。结果:86例原发性肝癌患者肝癌组织中MAGE-1、MAGE-3和AFP mRNA的阳性率分别为34.9%(30/86)、60.5%(52/86)和69.8%(60/86);所有患者肝癌组织至少表达其中一种mRNA。结论:MAGE-1、MAGE-3结合AFP mRNA在肝癌组织中表达率较高,有可能用于联合检测肝癌血行微小转移。

胃癌MAGE-1基因启动子B′B区去甲基化状态的研究

目的 :探讨胃癌组织中MAGE 1基因启动子B′B区去甲基化状态及其与病理分级及临床分期的关系。方法 :取胃癌组织标本 4 0例 ,另外取同患者相应的癌旁组织 4 0例作为对照。采用分子生物学技术 甲基化敏感性内切酶酶切及PCR扩增技术 ,研究了胃癌组织中MAGE 1启动子B′B区的去甲基化状态。结果 :在所检测的胃癌组织标本中MAGE 1基因启动子B′B区去甲基化的发生率为 2 5 % (10 /40 )。而在癌旁组织中发生率为 0 ,两者发生率的差别具有显著的统计学意义 (P <0 0 1)。在低分化腺癌中MAGE 1基因的B′B区去甲化发生率为 5 0 % (6 /12 ) ,中分化腺癌中发生率为 18.7% (3/16 ) ,高分化腺癌中发生率为 8.3(1/11)。其发生率的差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。在早期胃癌组织中B′B区的去甲基化的发生率为16 .7% ,在晚期胃癌组织中发生率为 2 8.6 % (P <0 .0 5 ) ,差别有统计学意义。结论 :胃癌组织中MAGE 1基因启动子的B′B区存在去甲基化。

人肿瘤特异抗原MAGE-3基因疫苗的构建和表达

目的 克隆肿瘤特异性共享抗原mage 3基因 ,制备基于α 病毒复制酶的高效黑色素瘤特异性基因疫苗。方法 用RT PCR方法从黑色素瘤细胞系LB3 73中制备mage 3基因 ,以含α 病毒复制酶的哺乳细胞高效表达质粒pSMART2a为载体 ,构建重组DNA疫苗。重组子用载体中的T7和T3启动子序列为测序引物进行自动测序。再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化 2 93细胞 ,用免疫印迹法和免疫组化法鉴定转化细胞中mage 3蛋白的表达。结果 正确构建了mage 3 pSMART2a重组质粒 ,并且在转化此质粒的 2 93细胞中检测出了mage 3蛋白的表达。结论 此重组mage 3 pSMART2a质粒可以作为肿瘤特异的DNA疫苗 ,可进行下一步的肿瘤动物模型的疫苗接种及相关免疫学效应研究。

肿瘤抗原MAGE-2多抗原肽疫苗的设计合成及免疫原性研究

目的 采用多抗原肽 (multipleantigenpeptide ,MAP)设计方案 ,提高线性短肽的免疫原性。方法 对肿瘤抗原MAGE 2 2 2 0 2 2 8细胞毒性T细胞 (cytotoxicTlymphocyte ,CTL)表位进行分子修饰 ,设计、合成四分支多抗原肽 (MAP4)。标准Fmoc合成方案进行合成 ,液相色谱 质谱联用 (LC MS)进行目的肽鉴定。以体外刺激人外周血单核细胞 (PBMC)诱导CTL效应及IFN γ分泌 ,标准 51 Cr释放实验与Elispot实验进行免疫原性的研究。结果 标经准 51 Cr释放实验验证 ,低浓度的MAP4可以诱导出有效的CTL效应 ,Elispot实验显示MAP4能够有效诱导的IFN γ分泌。结论 MAP的构建能够增强CTL效应和IFN γ的分泌 。

肿瘤抗原MAGE-2 HLA-A2限制性新CTL表位的鉴定

目的 寻求新的HLA A2限制性肿瘤抗原MAGE 2CTL表位。方法 经超基序与量化基序相结合预测的肿瘤抗原MA GE 2的 4个表位作为研究对象 ,标准的51 Cr实验与肽结合实验相结合进行验证。结果 预测表位肽MAGE 2 2 2 0 2 2 8,MAGE 2 2 71 2 79经体外刺激PBMC后可有效的诱导CTL效应产生 ,当效 靶为 10 0∶1时溶破靶细胞效率分别为 74 4% ,68 2 %。HLA A2分子亲和力分析 ,荧光系数分别为 0 61、0 2 4阳性肽荧光系数为 0 79。结论 多肽MAGE 2 2 2 0 2 2 8、MAGE 2 2 71 2 79可作为新的HLA A2限制性CTL表位。

肿瘤抗原MAGE-3HLA-A2限制性CTL表位的预测

目的预测肿瘤抗原 MAGE- 3的 HL A- A2限制性 CTL 表位。方法以肿瘤特异性抗原 MAGE- 3为研究目标 ,采用基序方案和二级锚点相结合的 CTL 表位预测方法。结果预测出了 MAGE- 3的 6个 HL A- A2限制性 CTL 表位。结论所预测出的 6个 HL A- A2限制性 CTL 表位经后续实验筛选、鉴定后 ,可用于基于 MAGE-