LFn-MAGE3融合蛋白表达及生物学功能初步研究

目的:表达融合蛋白LFn-MAGE3,探讨无毒炭疽毒素用于治疗肿瘤的可能性。方法:将LFn的编码序列导入PET21a表达载体中,构建LFn融合表达载体PET21a-LFn。将全长MAGE-3基因插LFn融合表达载体中,构建了PET21a-LFn-MAGE3融合蛋白表达载体。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达LFn-MAGE3融合蛋白。表达产物用QsepharoseFF离子交换柱和PheHP疏水柱进行纯化。LF毒性抑制实验和细胞免疫荧光实验检测融合蛋白的生物学活性。结果:融合蛋白LFn-MAGE3在大肠杆菌BL21a获得胞内可溶性表达,经纯化后,获得一定纯度的LFn-MAGE3融合蛋白。细胞免疫荧光实验显示LFn-MAGE3能在PA(炭疽保护性抗原)协同下高效进入巨噬细胞。结论:表达纯化获得的LFn-MAGE3融合蛋白能在PA协助高效进入细胞,可以用于下一步的肿瘤免疫治疗的动物实验中。

MAGE3 siRNA表达载体的构建及其沉寂作用

目的构建针对人MAGE3基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对MAGE3基因的干扰作用。方法设计MAGE3靶向的发夹状siRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPER.neo载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染胃癌细胞BGC823,采用RT-PCR检测MAGE3基因mRNA表达水平的变化。结果把针对MAGE3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pSUPER.neo载体,经过酶切鉴定与测序,结果正确;稳定转染人胃癌细胞BGC823后,RT-PCR检测显示,MAGE3基因的表达水平明显降低。结论成功构建了针对MAGE3基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制MAGE3基因表达。

小鼠胃癌MAGE3抗原H-2K^k限制性抗原肽的筛选

本研究对小鼠胃癌MAGE3抗原H 2Kk 限制性的抗原肽进行了筛选。用CTL表位预测的基序法对易与H 2Kk 结合的多肽序列进行了预测并人工合成了 4个多肽。在体外检测了各多肽刺激H 2Kk 型小鼠T细胞增殖和分泌IFN γ的能力 ,同时测定了各多肽诱导出的CTL对小鼠前胃癌细胞株MFC细胞的杀伤活性。结果显示 ,抗原肽MAGE31 3 0 1 3 7可有效地刺激特异性T细胞的增殖和分泌细胞因子IFN γ ,其诱导出的CTL细胞对MFC细胞也有较高的杀伤活性。这些实验结果证实抗原肽MAGE31 3 0 1 3 7可以作为多肽疫苗来对表达MAGE3抗原的H 2Kk 型小鼠胃癌进行免疫治疗。

RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉默对肺癌细胞定植和转移的影响

目的构建针对人MAGE3基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,观察RNA干扰介导的MAGE3基因表达默寂对肺癌细胞定植和转移的影响。方法设计MAGE3靶向的发夹状siRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPERneoGFP载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染人肺癌细胞NCI-H446,采用RT-PCR和Western印迹检测MAGE3基因mRNA和蛋白表达水平的变化。用软琼脂克隆形成实验和细胞体外侵袭实验,观察对肿瘤形成能力和侵袭力的影响。结果把针对MAGE3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pSUPERneoGFP载体,经过酶切鉴定与测序,结果正确;RT-PCR和Western印迹检测显示,MAGE3基因的表达水平明显降低;转染siRNA表达载体组的肺癌细胞在软琼脂中形成克隆数和穿透Matrigel的细胞数都显著下降,与未转染和转染空载体组比较差异有显著性(P<0.05)。结论成功构建了针对MAGE3基因的siRNA载体,RNA干扰介导的MAGE3基因表达沉寂可有效降低肺癌细胞定植和转移。

人黑色素瘤抗原-3冲击的树突状细胞诱导抗肿瘤免疫应答

目的 :观察经MAGE - 3蛋白抗原冲击的树突状细胞在体外诱导抗肿瘤免疫应答的能力。方法 :用粒-巨噬细胞集落刺激因子和白介素 - 4从人外周血分化、诱导树突状细胞 ,经MAGE - 3蛋白冲击后 ,与T淋巴细胞共培养 7d ,收集T淋巴细胞进行免疫应答及肿瘤细胞杀伤试验。结果 :与MAGE - 3冲击后的树突状细胞共培养的T淋巴细胞在体外能有效地杀伤MAGE - 3阳性的靶细胞。结论 :经MAGE - 3蛋白抗原冲击的树突状细胞 ,在体外能有效提呈抗原 ,激活抗原特异性CTL 。

MAGE-B3基因在多株胃肠道肿瘤细胞系中的表达

从转录和翻译两个水平检测MAGE B3基因在胃肠道肿瘤细胞系中的表达 ,以分析其在临床胃肠道肿瘤免疫治疗中的可行性。提取胃肠道肿瘤细胞株的总RNA后 ,RT PCR方法检测MAGE B3基因转录水平表达 ,采用间接免疫荧光法检测细胞中MAGE B3抗原。在转录水平除肠癌细胞株LOVO阴性外 ,其余 7株胃肠道癌细胞株MAGE B3基因表达均为阳性 ,而在蛋白水平所检测 8株胃肠道癌细胞株MAGE B3均显阳性表达。基于MAGE B3基因和抗原在胃肠道肿瘤细胞株中的高表达 ,可利用该基因或抗原作为靶分子进行免疫治疗。

肺癌患者MAGE-A3抗原表达及HLA-I类基因分布的初步研究

目的 检测MAGE -A3抗原在肺癌组织中的表达情况以及HLA -I类基因在肺癌患者中的分布水平 ,以预测能够应用以MAGE -A3抗原蛋白为基础的肿瘤疫苗进行肿瘤免疫治疗的肺癌患者的比例。方法 用SDS -PAGE和Westernblot方法检测 6 3例肺癌及其癌旁组织MAGE -A3抗原的表达情况 ;用PCR -SSP方法检测 70例肺癌及癌旁组织HLA -A1、A2、A2 4的分布频率。结果 6 3例肺癌患者中有 31例为MAGE -A3抗原表达阳性 ,其中 5例癌旁组织MAGE -A3抗原也为阳性。 70例肺癌患者中HLA -A1、A2、A2 4三个等位基因的分布频率分别为 4 .2 8%、5 4 .2 8%、5 0 .0 % ;70例癌旁组织中HLA -A1、A2和A2 4的阳性率分别为 4 .2 8%、6 0 .0 %和 5 2 .86 %。三等位基因中任一基因在肺癌组织出现的频率为 80 %。结论 肺癌患者中大约有 39%的个体能应用基于MAGE -A3抗原蛋白的肿瘤疫苗进行有效的肿瘤免疫治疗。

重组腺病毒载体Ad-CRT/MAGE-A3抑制肺腺癌细胞A549侵袭的体外研究

目的:探讨同时携带CRT基因及MAGE-A3基因的重组腺病毒载体转染人肺腺癌细胞A549后基因的表达及其对体外增殖、侵袭、凋亡及血管形成能力的影响。方法:Ad-CRT/MAGE-A3转染A549细胞,转染48h后以Western blotting法检测CRT及MAGE-A3蛋白的表达;MTT法检测Ad-CRT/MAGE-A3对A549细胞增殖的影响;Transwell方法检测Ad-CRT/MAGE-A3对A549细胞侵袭的影响;AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测Ad-CRT/MAGE-A3对A549细胞凋亡的影响;小管形成实验检测Ad-CRT/MAGE-A3对血管形成的影响。结果:转染48h,Western blotting结果显示转染Ad-CRT/MAGE-A3的A549细胞能够表达CRT及MAGE-A3蛋白;MTT检测结果显示Ad-CRT/MAGE-A3能够明显抑制A549细胞的增殖;Tran-swell检测结果显示Ad-CRT/MAGE-A3能够明显抑制A549细胞的侵袭能力;AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测结果显示Ad-CRT/MAGE-A3能够诱导A549细胞凋亡;小管形成实验结果显示Ad-CRT/MAGE-A3能够明显抑制血管形成。结论:Ad-CRT/MAGE-A3能够明显抑制A549的增殖及侵袭能力,诱导其凋亡,并能明显抑制血管内皮细胞血管生成,其作用机制可能与CRT及MAGE-A3蛋白同时表达后相互作用有关,提示Ad-CRT/MAGE-A3可以作为潜在的肺癌基因治疗的新方法。