抗凝剂在改良MAIPA法中对ITP患者血小板特异性自身抗体(GPⅡbⅢa和GPⅠbα)检测的影响

探究二价阳离子络合剂的抗凝剂在改良单克隆抗体俘获血小板抗原(MAIPA)法检测免疫性血小板减少症(ITP)患者血小板特异性自身抗体中的影响。分别留取ED-TA-K2和肝素钠抗凝的162例ITP患者标本,采用改良MAI-PA法检测血小板特异性自身膜糖蛋白IIbIIIa(GPIIbIIIa)和膜糖蛋白Ibα(GPIbα)。抗GPIIbIIIa抗体:单用EDTA-K2抗凝剂检出阳性77例,单用肝素钠抗凝剂检出阳性78例,双重检测阳性102例;抗GPIbα抗体:单用EDTA-K2抗凝剂检出阳性53例,单用肝素钠抗凝剂检出阳性51例,双重检测阳性72例。单一抗凝剂与双重抗凝剂比较差异有统计学意义(P<0.05)。二价阳离子络合剂的抗凝剂在改良MAIPA法检测ITP患者血小板特异性自身抗体中有一定影响,采用两种抗凝剂双重检测可提高自身抗体的检出率。

HPA-1a抗体MAIPA定量检测标准体系的建立

目的建立针对人类血小板抗原HPA-1a抗体的血小板抗原单克隆抗体特异性免疫固定定量检测(MAIPA)的标准体系。方法用MAIPA方法检测不同稀释度的标准HPA-1a抗血清,优化该方法的最佳实验条件,绘制线性标准曲线,并对该方法的敏感度、特异性、准确度和精密度进行了分析。结果经优化,确定MAIPA定量检测方法的最佳实验条件如下:铺板抗体羊抗鼠Ig G单抗:3μg/m L,血小板每孔2×107个,检测抗体小鼠抗人CD61单抗:20μg/m L,酶标羊抗人Ig G:稀释度1:10 000。该方法的线性检测范围是0-4 IU。该方法最低检测限至少为0.3 IU,批内变异系数为1.3%-3.6%,批间变异系数为4.0%-5.6%。特异性检测:用抗-A、抗-B、抗-H、抗-I、抗-P1、抗-Lewisa等试剂以及含其他抗体的抗血清进行试验,均无明显阳性。结论本研究建立的针对HPA-1a抗体的MAIPA定量检测的标准方法具有较高的敏感度、特异性、准确度和精密度,对于临床相关疾病的诊断和血小板安全输注具有重要的应用价值。

二价阳离子络合剂的抗凝剂在改良MAIPA法检测ITP患者血小板特异性自身抗体中的影响

目的：探讨二价阳离子络合剂的抗凝剂在改良MAIPA法检测ITP患者血小板特异性自身抗体中的影响。方法：选取159例ITP患者，采用改良MAIPA法分别检测EDTA-K2（络合二价阳离子）及肝素钠抗凝的ITP患者血浆，对两者检出率进行比较。结果：抗GPIb抗体检出情况：使用EDTA作为抗凝剂检出阳性88例（55.35%），肝素作为抗凝剂检出104例（65.41%），两者比较差异无统计学意义（χ^2=3.35，P〉0.05）；抗GPIIbIIIa抗体检出情况：使用EDTA作为抗凝剂检出阳性46例（28.93%），肝素作为抗凝剂检出91例（57.23%），两者比较差异有统计学意义（χ^2=8.99，P〈0.05）。结论：对于抗GPIIb/IIIa抗体，肝素作为抗凝剂的检出率要明显高于EDTA作为抗凝剂，而抗GPIb抗体，肝素作为抗凝剂与EDTA作为抗凝剂的检出率无明显差别。

重组表达糖蛋白GPIIIa片段偶联荧光微球分析人血小板抗原-1系统同种抗体

目的:应用偶联血小板GPIIIa重组表达片段的Luminex xMAP荧光微球,检测血小板抗HPA-1a和-1b抗体。方法:以倍比稀释成12个浓度(原液~1/2048)的抗HPA-1a WHO国际标准品,比较MAIPA和Luminex xMAP技术检测抗HPA-1a的灵敏度。以8份抗HPA-1a/b阴、阳性对照,36份WHO血小板抗体质控盲样,评估流式荧光微球技术检测抗HPA-1a和-1b的特异性。结果:MAIPA检测抗HPA-1a的灵敏度为滴度1/64(抗体浓度1.56 IU/ml),流式荧光微球检测的灵敏度远高于滴度1/2048(抗体浓度0.049 IU/ml)。微球分析法能特异性鉴别抗HPA-1a和-1b阴、阳性对照。36份盲样中,有1份样本,在高浓度对偶抗体的影响下,产生抗HPA-1b假阳性结果。其余样本的微球分析结果与预期结果相符,能准确检出抗HPA-1a和-1b抗体,而且与HLA和ABO抗体以及其它的血小板抗体(包括抗HPA-3b、-5b、-15b、-GPIb/IX和非HPA-1特异性的抗-GPIIb/IIIa)未发生交叉反应。结论:基于重组偶联血小板GPIIIa的流式荧光微球技术可灵敏、特异性检测血小板HPA-1系统抗体,适合于临床免疫性血小板减少症患者的抗体特异性鉴定。

流式微球技术检测血小板特异性抗体的研究进展

血小板特异性抗体的产生是引起特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)病人血小板减少及巨核细胞成熟障碍的重要原因,其诊断缺乏特异性的临床表现,主要依靠血小板特异性抗体的检测。单克隆抗体特异性血小板抗原固定术(MAIPA)是检测血小板特异性抗体的"金标准",具有高特异性、低敏感性等特点,但由于操作繁琐、耗时等原因未在临床实验室推广使用。近年来,基于流式细胞术检测血小板特异性抗体的技术研究报道,其敏感性高于MAIPA,解决了部分操作及耗时的问题,并具有利用微球编码进行联立血小板抗体检测等优点。本文就近年来该检测方法的研究进展作一综述。

一株鼠抗人CD36单克隆抗体的制备及应用

目的本研究通过已建立的稳定表达人血小板CD36的HEK293T细胞系,制备鼠源的抗人CD36单克隆抗体并进行特性鉴定。方法利用已经建立的稳定表达人血小板CD36的HEK293T细胞系对CD36(-/-)C57小鼠进行免疫,取脾脏与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选出阳性克隆。纯化单克隆抗体后,利用Western blot检测抗体结合活性。利用小鼠IgG类/单抗亚型鉴定试剂鉴定单克隆抗体的抗体亚型。通过流式细胞检测和血小板抗原单克隆抗体特异性免疫固定检测(MAIPA)鉴定其诊断应用价值。结果经筛选后得到一株杂交瘤细胞,抗体亚型为IgG2a,轻链为κ链,Western blot试验表明该单克隆抗体特异性识别人血小板CD36抗原。MAIPA结果显示,与商业化单克隆抗体FA6-152相比,该单克隆抗体灵敏度更高。结论成功制备了一种鼠抗人CD36单克隆抗体,为临床鉴定CD36抗体,筛选CD36阴性献血员提供了新的工具,也为今后进一步研究CD36在血液免疫疾病中作用机制提供了实验基础。

血小板特异性抗体检测对血小板减少性紫癜鉴别的诊断意义

目的探讨血小板特异性抗体(抗GPIb、抗GPIIb、抗GPIIIa)检测对区别免疫性与非免疫性血小板减少性紫癜诊断的临床价值。方法本院有70例血小板减少性紫癜患者,其中37例为免疫性血小板减少患者,33例为非免疫性血小板减少患者,应用单克隆抗体俘获血小板抗原技术(MAIPA)检测血小板特异性抗体(抗GPⅠb、抗GPⅡb、抗Ⅲa)。结果37例免疫性血小板减少患者中有26例血小板特异性抗体检测至少一项阳性,占70.2%。非免疫性血小板减少患者为6.1%。结论自体免疫性血小板减少性紫癜(AITP)患者血小板膜糖蛋白特异性抗体的总阳性率(抗GPIIb或抗GPIIIa或抗GPIb特异性自身抗体阳性)为70.2%,显著高于非免疫组6.1%(x2=29.97,P<0.05),因此,我们认为血小板特异性抗体检测是特异性较强的一项指标,对提高ITP确诊率及鉴别免疫性和非免疫性血小板减少性紫癜有重要的临床意义。

血小板膜GpⅣ、GpⅤ在慢性ITP发病中的意义

目的:了解血小板GpⅣ、GpⅤ在慢性ITP发病中的意义。方法:采用改良的单克隆抗体免疫固定特异血小板抗原(MAIPA)的方法检测38例慢性ITP患者血浆抗GpⅣ、GPⅤ抗体水平,评估GpⅣ、GpⅤ在慢性ITP中的意义。结果:在38例患者中,1例抗GpⅤ抗体阳性,阳性率为2.6％;2例抗GpⅣ抗体阳性,阳性率为5.3％,并且在这2例患者中,1例同时存在血浆抗GpⅡb/Ⅲa抗体。结论:(1)GpⅣ是慢性ITP自身抗体的一个靶抗原,并且在某些患者体内可同时存在抗GHⅡb/Ⅲa自身抗体。(2)在慢性ITP,GpⅤ分子上亦含有自身抗体的靶抗原。

抗凝剂对ITP血小板特异性自身抗体检测的影响及抗体种类与糖皮质激素疗效的相关性

目的:探讨改良单克隆抗体俘获血小板抗原(MAIPA)法中EDTA(二价阳离子熬合剂)和肝素钠抗凝剂对检测免疫性血小板减少性紫癜(immune thrombocytopenia,ITP)患者血小板特异性自身抗体检测的影响,并研究ITP患者血小板特异性自身抗体种类与糖皮质激素治疗效果差异。方法:分别留取EDTA和肝素钠抗凝的ITP患者标本140份,采用改良MAIPA法分别检测血小板特异性自身抗体(GPIIb/IIIa和GPIbα),比较两种抗凝剂的检测结果的差异。结果:140例患者EDTA抗凝组检出GPIIb/IIIa抗体阳性55例,肝素抗凝组检出GPIIb/IIIa阳性76例,两者阳性重复42例;其中EDTA组阳性而肝素组阴性者13例,肝素组阳性而EDTA组阴性者34例,两者比较差异有统计学意义(x2=9.38,P<0.05)。140例患者EDTA抗凝组检出抗GPIbα抗体阳性62例,肝素抗凝组阳性51例,两者重复42例;其中EDTA组阳性而肝素组阴性者20例,而肝素组阳性EDTA组阴性者9例,两者比较差异无统计学意义(x2=3.44,P>0.05)。320例患者采用标准糖皮质激素治疗,抗GPIbα抗体阳性143例,有效率39.9%,抗GPIbα抗体阴性177例,有效率79.7%,两者比较差异有显著性(x2=53.115,P<0.05)。结论:EDTA抗凝剂对改良MAIPA法检测ITP患者血小板特异性自身抗体(GPIIb/IIIa)有影响;抗GPIbα抗体阳性可能是ITP患者糖皮质激素治疗不敏感的重要影响因素之一。

血小板抗体检测方法的比较及其临床应用

单克隆抗体固相化（MAIPA）、抗心磷脂抗体检测（ACA）、狼疮抗凝物质检测（LA）、酶联免疫吸附竞争法对ITP、输注血小板悬液和非ITP血小板减少症患者进行了抗血小板抗体的检测比较。结果表明，在ITP中MAIPA法的特异性显著高于酶联免疫吸附竞争法（P＜0．05）。在输注单产血小板悬液的6例患者中，均于输后第2、3周PAIgG明显升高。ACA检测在ITP组中的阳性率为23％，LA在ITP组和白血病组中的阳性率分别为9％、20％。最后又对两种方法的比较进行评价及血小板抗体检测的临床应用进行讨论。

国内首例抗HPA-5b引发的新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜的检测、诊断及分析

本研究旨在探讨抗HPA-5b抗体引发的新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜(NAITP)的实验检测及临床诊断。临床监测患儿血小板计数及其他临床表现;多重PCR及DNA测序检测患儿及其父母HPA-1-21bw系统基因型;流式细胞术(FCM)和血小板抗原单克隆抗体特异性免疫固定检测技术(MAIPA)检测及鉴定患儿及其母亲血清中的血小板特异性抗体。结果表明:患儿临床症状较轻,基因分析显示患儿为HPA-5ab,父亲为HPA-5ab,母亲为HPA-5aa;患儿母亲血清中含与父亲血小板反应的血小板特异性抗体为抗HPA-5b抗体。结论:该病例为抗HPA-5b抗体引起的新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜。

双血小板抗原型不合引起的母婴同种免疫性血小板减少症

为证实可疑母婴同种免疫性血小板减少症（FMAIT）的病例存在多血小板原型不合的可能。我们用敏感且较特异的单克隆抗体特异性血小板抗原因相化方法（MAIPA）检测母体血清中的同种抗体，以改良的ELISA血小板抗原型表达法同时检测患儿及其父母的血小板抗原型。结果显示：母体血清中存在强IgG型抗血小板抗原-3a（抗HPA－3a）和抗血小板抗原-5b（抗HPA－5b）。患儿血小板抗原型为HPA－1a／1a，HPA－3a／3a，HPA－5b／5b；母亲血小板抗原型为HPA－1a／1a，HPA－3b／3b，HPA－5a／5a。我们发现的FMAIT是双血小板抗原型不合所致，也是第一例由抗HPA-3a和抗HPA-5b引起的FMAIT。我们认为临床上大剂量免疫球蛋白辅以同型血小板的治疗是有效的。

广西地区汉、壮和瑶族人群CD36缺失结构实验分析和特征研究

目的建立CD36缺失结构的试验鉴定方法,调查广西地区汉、壮、瑶族人群CD36缺失频率及分布特征。方法建立血小板流式细胞荧光免疫检测试验(PIFT-FC)对广西地区4 621名无血缘关系的汉、壮、瑶等民族献血者血小板CD36的表达作筛查,以血小板抗原单克隆抗体特异性免疫固定试验(MAIPA)对初筛CD36缺失者复检,以单核细胞流式细胞荧光免疫检测试验(MIFT-FC)检测CD36缺失者的单核细胞CD36的表达,对CD36缺失型个体作缺失型的亚型分型及CD36缺失结构的研究。结果 PIFT-FC和MAIPA筛查出广西汉、壮、瑶族个体CD36的总体缺失率是4.13%(191/4 621),其中汉族人群的缺失率为3.59%(109/3 036)、壮族为5.76%(80/1389)、瑶族为2.38%(2/84)。对其中117名CD36缺失个体分型检测:Ⅰ型CD36缺失的总体比例为41.03%(48/117),分别是汉族人群39.19%(29/74)、壮族43.90%(18/41)、瑶族50%(1/2);Ⅱ型CD36缺失的总体比例58.97%(69/117),分别是汉族人群60.81%(45/74)、壮族56.10%(23/41)、瑶族50%(1/2)。结论成功建立PIFT-FC、MAIPA和MIFT-FC试验;广西汉、壮、瑶民族人群间的CD36缺失结构有差异,壮族人群CD36缺失率较高,显示出其民族特征。

慢性ITP患者血小板膜表面GPⅣ、GPⅤ特异性自身抗体的测定

目的 :检测慢性ITP患者血小板膜表面GPⅣ、GPⅤ特异性自身抗体。方法 :应用改良直接MAIPA(单克隆抗体俘获血小板抗原技术 )检测血小板膜糖蛋白 (GPⅣ、GPⅤ )特异性自身抗体。结果 :慢性ITP患者血小板洗脱液中GPIV特异性和GPV特异性自身抗体的阳性率分别为 6. 3%和 4. 8%。结论 :血小板膜GPⅣ、GPⅤ分子是慢性ITP自身抗体的靶抗原 ,但多与GPⅡb

CD109表达量及保存方法的相关性研究

目的分析中国南方人群HPA-15基因型分布频率,研究血小板上HPA-15抗原表达量。寻找较好的血小板保存方法以维持HPA-15的高表达量,为单克隆抗体俘获血小板抗原技术(MAIPA)检测HPA-15同种抗体提供合适的供者血小板。方法 1)随机选取广州血液中心的健康血小板单采献血者109名,留取EDTA抗凝管全血。SSPPCR方法检测HPA-15基因型。流式细胞术检测血小板上HPA-15抗原表达量。2)另随机选取健康献血者的单采血小板67例,将每份血小板分为2份,1份重悬于EDTA-PBS中放于4℃保存作为检测组A,另1份留于血小板辫子中放于血小板振荡仪中作为检测组B,在d 0、1、2、3、7、14检测2组血小板上HPA-15的检测含量,比较2组HPA-15含量的变化。结果 1)109名随机健康献血者HPA-15a和HPA-15b的基因频率是0.495和0.505。流式细胞术检测HPA-15抗原的MFI值的范围2.44-20.4,阳性率3.2%-86.7%。不同HPA-15基因型之间,HPA-15抗原表达量有统计学差异(P<0.05)。2)分析比较AB这2个组,随着测量时间点的推移,2组HPA-15的表达量均有降低,但检测组B中HPA-15的表达含量高于检测组A,且2组的MFI值有统计学差异(P<0.05)。结论 HPA-15a和HPA-15b的基因分布频率相近,HPA-15抗原表达含量整体水平偏低且个体差异性大。体外保存方式下,HPA-15的表达含量随着时间推移逐渐降低,4℃保存方式下HPA-15含量降解尤为明显。血小板振荡仪中保存血小板的方法为MAIPA检测HPA-15抗体提供更合适的血小板抗原。

恶性肿瘤非免疫性血小板减少患者血小板特异性抗体的研究

目的检测恶性肿瘤非免疫性血小板减少患者的抗血小板特异性抗体,评价单克隆抗体特异性俘获血小板抗原(MAIPA)诊断及鉴别诊断价值。方法用改良的MAIPA法检测抗血小板GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ的特异性抗体。结果恶性肿瘤非免疫性血小板减少患者的血小板特异性抗体阳性率低。结论抗血小板特异性抗体对鉴别免疫性与非免疫性血小板减少具有重要临床意义。