基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱鉴定鲨鱼硒结合蛋白

利用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)高置信度地鉴定了原核表达的白鳍鲨硒结合蛋白。实验表明,硒结合蛋白肽段之一被错误指认为胰酶自水解峰和混合谱是影响其未进行串联质谱分析或不能被数据库搜索匹配的主要原因,同时还发现,虽然赖氨酸结尾肽段在MALDI源中信号强度普遍很低,但对它们进行串联质谱分析也可获得较好的谱图质量,部分数据可用于从头测序。考虑以上因素后,硒结合蛋白鉴定覆盖率由35%增至51%。

液相色谱-离子阱-飞行时间串联质谱同时检测肉制品中14种杂环胺

建立了液相色谱-离子阱-飞行时间串联质谱(LCMS-IT-TOF)同时测定肉制品中14种杂环胺(HAAs)残留量的分析方法。样品以乙腈提取,经Phenomenex strata-X-C小柱净化,甲醇-氨水(9∶1)洗脱,氮吹至干,经1 mL乙腈-水(1∶9)定容离心后上机测定,基质曲线内标法定量。结果表明,14种杂环胺在5～250μg/L质量浓度范围内线性良好,相关系数均不低于0.994 0,检出限(S/N=3)为0.59～3.27μg/kg。14种杂环胺在加标水平为10、50、250μg/kg时的回收率分别为69%～107%、67%～106%、76%～113%,相对标准偏差(RSD,n=6)分别为1.5%～15.6%、1.3%～11.8%、1.8%～9.7%。结果显示该方法线性范围宽,精密度和准确度较高,分析时间短,净化效果好,可满足肉制品中多种杂环胺残留同时检测的要求。

串联飞行时间质谱的碎片离子相对强度在区分亮氨酸和异亮氨酸残基中的应用

研究肽段从头测序需要解决的问题之一是区分亮氨酸和异亮氨酸残基,利用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）所产生的w型离子区分这两种氨基酸残基是目前最常用的方法。本研究以6对合成的同分异构肽段（由7～15个氨基酸构成）为例,来说明w离子信号强度较低且有时不能产生,在区分多肽中的亮氨酸和异亮氨酸时受肽段长度和序列的限制。而亮氨酸与异亮氨酸的变化会导致亚胺相关离子、内部断裂离子、b-型和y-型离子等相对强度的微小变化。通过比较这些骨架断裂变化所产生的微小差异,可为区分肽段中的亮氨酸和异亮氨酸残基提供新的线索和判据。

MALDI-TOF应用中控制浓度和干燥的重要性

MALDI-TOF质谱是分子生物学领域中最有效的工具之一。它可以用来表征相对分子质量范围在400～350000的生物分子,例如蛋白质、肽、寡糖和寡核苷酸。样品按照本文的方法进行认真处理后,可以获得很高的检测灵敏度。

杜仲化学成分的LC-Triple TOF MS/MS分析

采用液相色谱-三重四极杆飞行时间串联质谱(LC-Triple TOF MS/MS)法分析杜仲中的化学成分。实验使用反相C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱;采用ESI离子源的正、负离子扫描方式对样品进行分析。根据高分辨质谱提供的准分子离子和碎片离子的精确分子质量信息,并结合标准品对照与相关文献数据,共鉴定出35种化学成分,包括13种木脂素类、11种环烯醚萜类、9种苯丙素类和2种黄酮类成分。该实验可为杜仲的药效物质基础和品质评价等进一步研究提供基础资料。

UPLC⁃Q⁃TOF⁃MS^(E)法分析黄精在九蒸九晒过程中的差异代谢物

目的基于超高效液相色谱⁃串联四极杆飞行时间质谱(UPLC⁃Q⁃TOF⁃MS^(E))法分析黄精在九蒸九晒过程中的差异代谢物。方法取生品、一蒸一晒品、三蒸三晒品、五蒸五晒品、七蒸七晒品、九蒸九晒品各6批,经预处理后采用UPLC⁃Q⁃TOF⁃MS^(E)法检测代谢产物,主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘分析(OPLS⁃DA)。结果生品、炮制品在负离子模式下共鉴别处37种差异代谢物,其中生品与一蒸一晒品、三蒸三晒品、五蒸五晒品、七蒸七晒品、九蒸九晒品的差异代谢物分别有33、30、30、25、27种,以甾体皂苷为主。结论本实验可为黄精九蒸九晒机制的研究提供科学依据。

基于UPLC-Triple TOF MS/MS技术分析不同产地何首乌的差异化学成分

为了探讨不同产地对何首乌代谢物合成积累的影响,采用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间高分辨质谱法(UPLC-Triple TOF MS/MS)结合多元统计分析技术对不同产地何首乌中差异性化学成分进行研究。通过二级串联质谱分析,对其质谱数据进行峰匹配、峰对齐、滤噪处理等,以提取特征峰;用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)进行数据处理;根据一级质谱精确质荷比和二级质谱碎片信息,结合软件数据库搜索及相关文献进行成分鉴定。结果显示,4个不同产地的何首乌样品间的化学组成可得到有效区分;初步筛选出36种差异显著的化学成分并鉴定出33种成分,其中有12种共有差异化学成分呈现不同的变化规律。该结果可为揭示产地对何首乌代谢物合成积累的影响规律提供基础资料。

GC-Q/TOF MS技术快速鉴定防风挥发油中的成分

采用气相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(GC-Q/TOF MS)技术对中药防风挥发油中的化学成分进行鉴定。首先在标准EI电离源模式下采集样品,通过定性软件对数据进行解卷积和NIST库比对,鉴定出库内化合物82种,包括烃类、醛酮类、醇类、酸类和酯类。此外,采用GC-Q/TOF MS的低能量电离源(Lower energy)模式,确定未知化合物的分子离子峰;采集二级质谱,获得碎片离子信息,推断分子式,并结合Chemspider数据库,鉴定了未知物结构。运用该方法鉴定出NIST库外化合物2种,分别为(5E,7E,11S)-5,11-二甲基-5,7-十四碳二烯-1-炔-4-醇和(6S,7E,9E)-7,9-十七碳二烯-11,13-炔-6-醇。同时鉴定了库内化合物3种,为2,4-癸二烯醛、肉豆蔻酸和棕榈酸甲酯,与自动匹配结果相一致,验证了该方法的可行性。综上,从防风挥发油中共鉴定出84种化学成分。该研究丰富了GC-Q/TOF MS在中药防风挥发油中的运用,也为其他物质的快速全面鉴定提供了新思路,尤其是GC-Q/TOF MS的Lower energy和MS/MS联用模式适用于NIST库中未收录化合物的准确快速鉴定。

高分化星形细胞瘤的蛋白质组学研究

目的研究高分化星形细胞瘤差异蛋白质表达,为星形细胞瘤的治疗及预后的判断提供依据。方法取经病理证实的29例正常脑组织及36例高分化的星形细胞瘤(KernohanⅡ级),经蛋白电泳、染色,采用PDQUEST和2-DE分析系统软件进行分析。以MALDI-TFO质谱或MALDI-TOF/TOF串联质谱技术结合数据库检索对蛋白质进行鉴定。结果通过双向电泳得到正常脑组织和高分化星形细胞瘤标本的双向凝胶电泳图谱;生物质谱技术鉴定了24个差异蛋白质点,与正常脑组织相比,高分化星形细胞瘤有9个蛋白质下调,15个蛋白质上调。结论以蛋白质组学技术鉴定了正常脑组织和高分化星形细胞瘤的差异蛋白质,其中部分蛋白质有助于深入研究星形细胞瘤的发生、发展机制并对进一步发现肿瘤标记物及治疗靶点有重要的参考价值。

额颞叶痴呆的蛋白质组研究

目的 为深入理解额颞叶痴呆分子机制并寻找诊断治疗该疾病的蛋白质标记物,选取5例经病理证实的额颞叶痴呆患者与4例无神经系统疾病老年人尸检脑标本进行蛋白质组学研究.方法 死亡24 h内新鲜取材的尸检额叶、颞叶蛋白质以固相pH梯度等电聚焦为第一向,SDS-PAGE垂直电泳为第二向进行双向电泳（2-DE）,图象分析软件Imagemaster 2D Elite分析电泳图谱,MALDI-TOF质谱或MALDI-TOF/TOF串联质谱鉴定蛋白质.结果 18种蛋白质的表达量在额颢叶痴呆患者与正常老年人显著不同.12个在额颞叶痴呆表达量上调的蛋白质被鉴定为3-磷酸甘油醛脱氢酶、尿嘧啶DNA糖苷水解酶、Cu-Zn超氧化物歧化酶、异柠檬酸脱氢酶亚单位、synaptotagmin I、Peroxiredoxin2、胶质纤维酸性蛋白、P25 alpha、烯酰辅酶A水合酶短链1、吡哆醇-5′-磁酸氧化酶、Mn超氧化物歧化酶、α-烯醇化酶;6个在额颞叶痴呆表达量下调的蛋白质被鉴定为抗氧化蛋白2（酸性钙离子依赖型磷脂酶A）、铁蛋白H链、谷氨酸脱氢酶、肽基脯氨酸顺反异构酶A、血清白蛋白前体、二氢嘧啶酶相关蛋白2.结论 额颞叶痴呆患者脑组织中神绛纤维缠结相关蛋白、氧应激蛋白、凋亡相关蛋白及重要代谢酶的表达发生变化,有助于深入理解额颞叶痴呆分子机制并有望在额颞叶痴呆的早期诊断及新药开发上发挥作用.

绍兴黄酒混浊蛋白的分离鉴定及其氨基酸组成、二级结构分析

采用双向电泳及基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱法分析了绍兴黄酒混浊蛋白的主要组成及来源,结果表明:绍兴黄酒混浊中的蛋白质主要包括来源于小麦类燕麦蛋白b1、类燕麦蛋白、二聚-α淀粉酶抑制剂、病程相关蛋白、病程相关蛋白-4、几丁质酶II,以及来源于水稻的类燕麦蛋白和β-淀粉酶。高效液相色谱与傅里叶变换红外线光谱分析法分析绍兴黄酒上清蛋白质和混浊蛋白质的氨基酸组成与二级结构发现,绍兴黄酒混浊蛋白中谷氨酸含量最高,占总氨基酸含量的20.48%,疏水性的氨基酸含量比酒体蛋白高24.2%。高α-螺旋含量、低β-折叠和无规则卷曲是黄酒混浊中蛋白质的主要结构特征。

液相色谱-质谱技术结合网络药理学研究附子-葶苈子药对的抗心力衰竭作用机制

采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱(UPLC-Q TOF MS^(E))技术,结合UNIFI软件对附子-葶苈子药对水煎液中的化学成分进行分析鉴定。首先,在UPLC-Q TOF MS^(E)正、负离子模式下采集质谱数据,使用UNIFI软件对化合物精确相对分子质量和串联质谱数据进行辅助解析,结合对照品的质谱信息及相关参考文献,从附子-葶苈子共煎液中共鉴定出142个化合物。以这些成分为候选化合物,采用网络药理学方法,构建了“药物-成分-靶点”关键网络,筛选出附子-葶苈子药对治疗心力衰竭的10个关键靶点,分别为BCL2、IL6、STAT3、CASP3、PPARG、ESR1、EGFR、AKT1、MMP9、PTGS2,它们主要参与调控糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、表皮生长因子受体信号通路以及缺氧诱导因子信号通路等;活性成分包括水黄皮素、山柰酚、异鼠李素等黄酮类和惰碱、德尔妥因等生物碱类以及穿心莲内酯类化合物。该研究揭示了附子-葶苈子配伍抗心力衰竭的潜在作用机制,为该药对的临床应用提供了科学依据。

根据蛋白质Z的糖基化特性监控制麦过程

糖基化是蛋白质非酶修饰的一种常见形式。尽管食品中蛋白质的糖基化许多年前已为大家所知，对糖基化产物的定性与定量分析仍然是一项富有挑战性的工作。本文研究了大麦蛋白质z的糖基化作用。大麦麦芽中的蛋白质Z是影响啤酒成分的最重要蛋白质之一。本实验通过凝胶电泳，液相色谱和质谱的联用对制麦时期的这一修饰过程进行了研究。在制麦的不同阶段于大麦谷粒中提取水溶性蛋白，进而利用凝胶电泳方法分离，大麦蛋白质Z的条带清晰的出现在43KDa处。再进行基于辅助基质激光解吸技术的质谱分析，研究发现在制麦的第二天就可以检测到蛋白质z的糖基化，糖基化后的多肽在质谱中m／z为2619。为了验证糖基化的影响，又进行了串联质谱实验（MS／MS），同时检测到了未修饰的多肽（m／z为2457）和已修饰的多肽（m／z为2619）。本研究成功的建立了一种监控制麦过程的方法，该方法利用质谱分析技术，以蛋白质z为标准参照物，对糖基化多肽进行监控。研究证实了利用串联质谱分析的可行性，通过该方法可以获得更多多肽修饰方面的信息。

褶牡蛎氨肽酶B的分离纯化和性质研究

氨肽酶是一类能特异水解蛋白质N端氨基酸残基的外切酶,在食品行业有着广阔的应用前景。以褶牡蛎(Alectryonella plicatula)为原料,通过硫酸铵盐析,DEAE-sepharose,phenyl-sepharose及羟基磷灰石柱层析,分离纯化得到了一种高效水解碱性氨基酸的氨肽酶,其活性能被氨肽酶特异性抑制剂bestatin有效抑制。双向电泳结果显示该酶的分子质量约为100 ku,pI约为5.8。通过肽质量指纹图谱对其进行鉴定得到12个肽段,共含138个氨基酸残基,这些氨基酸序列与太平洋牡蛎中嘌呤霉素敏感性氨肽酶一致,表明纯化的酶为氨肽酶B。褶牡蛎氨肽酶B的二级结构以无规卷曲与反向平行为主,其中无规卷曲占42.6%,反向平行占32.0%。动力学研究获得其K_m和k_(cat)值分别为1.5μmol/L和117.5 s^(-1),k_(cat)/K_m为78.3 L/(μmol·s)^(-1)。在35℃,pH值7.0的条件下,该酶具有最大催化活性,能高效水解氨肽酶底物Lys-MCA和Arg-MCA,释放出游离态的Lys和Arg,推测与牡蛎呈味相关。

铝胁迫下不同桉树无性系叶差异蛋白表达分析

为了研究桉树不同无性系在铝处理下的叶片蛋白表达的差异,并从分子生物学角度预测与阐释桉树耐铝性机制,以巨尾桉(Eucalyptus grandis×E.urophylla)9号、巨尾桉(E.grandis×E.urophylla)12号、韦赤桉(E.wetarensis×E.camaldulensis)3号和尾叶桉(E.urophylla)4号苗木为材料,并对其进行铝处理。结果表明:从4种无性系叶所得蛋白有明显的上调或下调表达。通过丰度计算,共得蛋白点(P<0.05)98个,巨尾桉9号为14个、巨尾桉12号为38个、尾叶桉4号为33个、韦赤桉3号为13个。经质谱分析,有11个蛋白成功鉴定,包括1个Ru Bis CO、3个Ru Bis CO LSU、1个放氧增强蛋白、1个叶绿素a/b结合蛋白、3个2-半胱氨酸过氧化物酶、1个质体谷氨酰胺合成酶、1个3-磷酸甘油醛脱氢酶,其主要功能与植物自身N和能量代谢以及抗氧化和光合作用等有关。4种不同的桉树无性系应对铝胁迫时有不同的应答机制,差异蛋白质呈现不同的表达量,并且从该角度分析耐铝性最强的是巨尾桉9号,而较弱的是尾叶桉4号。

盐胁迫下三倍体小黑杨杂种无性系叶片蛋白质差异表达分析

【目的】探究三倍体小黑杨生长迅速原因。通过蛋白质差异表达分析,深入研究三倍体小黑杨生长发育机理,为其优质高产育种提供参考。【方法】以三倍体小黑杨杂种无性系为材料,分别用75 mmol/L NaCl溶液胁迫处理0、4、8、12和16 d,利用蛋白质双向电泳和MALDI-TOF/TOF质谱技术,探讨其不同处理条件下叶片差异表达蛋白。【结果】共检测到4000多个蛋白点,包含96个差异蛋白点,其中盐胁迫4、8、12、16 d与对照相比,分别鉴定出5、21、36、34个差异蛋白点,对60个蛋白点进行质谱鉴定,这些蛋白按功能可分为8类:其中光合作用占25%、能量代谢占20%、氧化还原作用占12%、抗性蛋白占8%、生物合成和代谢占7%、运输蛋白占3%、信号转导占2%和未知蛋白占23%。【结论】三倍体小黑杨杂种无性系受到盐胁迫后,多种蛋白质共同参与应答,其中主要是光合作用和能量代谢相关蛋白,本研究可以为盐胁迫下林木蛋白质组学研究提供基础。