MALDI-TOF-MS结合引物延伸反应检测K-ras基因型方法的建立

目的:建立MALDI-TOF-MS结合引物延伸的方法检测K-ras基因12位密码子7种基因型的研究模型并探讨其应用价值。方法:以自行构建的K-ras质粒DNA为模板,经目的片断扩增,去磷酸化,再用两条未经修饰的普通引物,在dATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP混和物存在的体系中进行引物延伸反应,最后用MALDI-TOF-MS检测引物延伸产物质荷比(m/z),得到质谱图,根据质谱图中各个峰的峰值进行基因分型研究。结果:用MALDI-TOF-MS结合引物延伸的方法,可以准确区分7种不同基因型。该方法可同时对384份样品进行检测。结论:MALDI-TOF-MS结合引物延伸的方法准确度高,反应体系稳定并具有快速、高通量、自动化的特点,可能成为肿瘤早期诊断的检测方法。

Primer Extension-DHPLC检测线粒体DNA 12SrRNA常见耳聋相关突变方法的建立~△

目的建立针对线粒体DNA 12SrRNA基因常见耳聋相关突变的Primer Extension-DHPLC(PE-DHPLC)基因诊断新方法。方法将包含线粒体DNA 12SrRNA 961insC、T1095C、C1494T、A1555G 4种不同突变的4例外周血DNA样本和4例正常对照标本经测序验证,PCR扩增靶序列,设计延伸引物,延伸后得到线粒体DNA 12SrRNA基因961insC、T1095C、C1494T、A1555G 4个常见突变的特异性延伸片段,用全变性高效液相色谱分析延伸片段混合物,分离图谱鉴定被检样本的基因型。结果 4例包含线粒体DNA 12SrRNA基因4种耳聋相关突变的DNA样本均扩增出包含4种突变的975 bp特征性条带,PE-DHPLC检测结果显示突变者有引物峰和突变峰两个峰,完全可以鉴别出4种突变,而4例正常对照标本仅显示单个引物峰。结论本实验建立了Primer Extension-DHPLC的线粒体相关耳聋突变分析新方法,可用于耳聋的基因诊断。

顺序特异性引物法对胰腺癌K-ras基因点突变的研究

为研究简捷、特异、敏感的检测胰腺癌Ｋｒａｓ基因点突变的方法及其在胰腺疾病中定性诊断的价值，采用针对该基因点突变方式（ＣＧＴ、ＧＡＴ、ＧＴＴ）设计的顺序特异性引物（ＳＳＰ），先后对胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、细针穿刺组织及胰液进行多聚酶链反应（ＰＣＲ），扩增产物借助常规电泳和染色检测有无Ｋｒａｓ基因突变及突变方式。结果显示：胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、细针穿刺组织及胰液中Ｋｒａｓ基因点突变率分别为７４．２％、９５．１％、９１．４％及９４．１％，而所有被检测的慢性胰腺炎、胰岛素瘤、壶腹癌、胆管癌、十二指肠乳头癌及外伤胰腺的组织标本和胰液标本均无Ｋｒａｓ基因突变，无假阳性发生。研究表明：该检测法快速、简便、特异、敏感，具有临床实用性，可以作为鉴别胰腺肿块良。

顺序特异性引物法快速检测胰腺癌K-ras基因点突变

目的 研究简捷、特异、敏感的检测胰腺癌K-ras基因点突变的方法及其在胰腺疾病中定性诊断的价值。方法 采用针对K-ras基因点突变方式（CGT、GAT、GTT）设计的顺序特异性引物（SSP）,先后对胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、细针穿刺组织及胰液进行多聚酶链反应（PCR）,扩增产物借助常规电泳和染色检测有无K-ras基因突变及突变方式。结果 胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、细针穿刺组织及胰液中K-ras基因点突变率分别为74.2％、95.1％、91.4％及94.1％,而所有被检测的慢性胰腺炎、胰岛素瘤、壶腹癌、胆管癌、十二指肠乳头癌及外伤胰腺的组织标本和胰液标本均无K-ras基因突变发生。结论 该检测法简便、快速、特异、敏感,具有临床实用性,可以作为鉴别胰腺肿块良恶性和诊断胰腺癌的一种方法。

结直肠癌组织中K-ras基因的检测及其意义

目的 观察结直肠癌组织中K-ras基因的表达情况,并分析其与临床病理学的相互关系,为临床筛选出能从生物靶向治疗中获益的人群.方法 对208例结直肠癌组织标本,使用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增目的基因（包含12和13密码子）,并对扩增产物进行Sanger法测序,进行K-ras基因的检测,结合相关的临床病理学资料,分析K-ras基因的表达状况同临床病理学的关系.结果 208例结直肠癌组织中K-ras基因12或13密码子突变为91例,突变率为43.8%,突变率在男女性别之间、肿瘤位置、组织分化类型和Duke＇s分期间差异无统计学意义.结论 对结直肠癌组织K-ras基因的表达状况进行检测有助于临床筛选出针对抗EGFR靶向治疗药物有效的结直肠癌患者.