MALDI-TOF-TOF-MS对完整蛋白质C端序列的直接测定

C-terminal sequencing is important for characterized the primary structure of protein and polypeptides and it must do for quality control of recombination protein drugs.A method of MALDI-TOF-TOF-MS with in source decay(ISD) to measure C-terminal sequence of protein was established.This method was applied successfully to measure C-terminal sequence of Neuregulin,TP-Ⅱ,ubiquitin,and myoglobin,respectively and 10,24,24 and 36 amino acid residue of C-terminal were measured.

家蚕抗BmNPV品系与感性品系血淋巴液蛋白质组的差异分析

利用遗传学的原理,通过杂交和回交的方法,建立家蚕抗BmNPV、感BmNPV以及近等基因系模型,利用2-D电泳和MALDI TOF/TOF MS质谱技术,从蛋白质组水平上研究家蚕对BmNPV抵抗性。其结果是获得家蚕高抗NB,高感306,近等基因系BC_8五龄起蚕血淋巴液蛋白质差异表达谱,分别获得180、190、187个蛋白点,其中80%的蛋白点集中在等电点5～9范围之内。从三块凝胶上共获得明显差异蛋白点12个,由质谱鉴定出5种蛋白,其中氨基酰化酶(Aminoacylase)仅出现在抗性品系NB、近等基因系图谱中,感性品系没有出现,初步推测是家蚕抗BmNPV特有蛋白,这是首次报道结果。

鸟结核分枝杆菌感染巨噬细胞后的外泌体刺激巨噬细胞产生的细胞因子及其蛋白质表达改变

目的探讨鸟结核分枝杆菌(M.avium)感染巨噬细胞后分泌的外泌体[(+)外泌体]刺激巨噬细胞后产生的分子免疫机制及其差异蛋白质成分研究。方法冷冻高速离心法收集经鸟分枝结核杆菌感染及未感染的巨噬细胞上清中的外泌体,然后利用外泌体刺激巨噬细胞;ELISA方法检测经外泌体刺激巨噬细胞后细胞上清中IFN-γ、TNF-α的含量;流式细胞术从蛋白水平检测巨噬细胞受外泌体刺激后CD80、CD86蛋白表达情况;2-DE MALDI-TOF/TOF MS技术分析鉴定巨噬细胞受M.avium感染后分泌的外泌体中的差异蛋白。结果 IFN-γ、TNF-α在(+)外泌体刺激巨噬细胞后培养上清中含量增加;CD80、CD86蛋白在巨噬细胞受(+)外泌体刺激后表达上调。外泌体经2-DE MALDI TOF/TOF MS分析获得18个差异蛋白,且质谱成功鉴定12个。结论 (+)外泌体促进巨噬细胞TNF-α、IFN-γ的分泌从而增强巨噬细胞的炎症反应,并且可促进巨噬细胞CD80、CD86蛋白表达增强;筛选出差异蛋白的功能与细胞骨架结构、蛋白质合成与加工,炎症反应密切相关。

绍兴黄酒混浊蛋白的分离鉴定及其氨基酸组成、二级结构分析

采用双向电泳及基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱法分析了绍兴黄酒混浊蛋白的主要组成及来源,结果表明:绍兴黄酒混浊中的蛋白质主要包括来源于小麦类燕麦蛋白b1、类燕麦蛋白、二聚-α淀粉酶抑制剂、病程相关蛋白、病程相关蛋白-4、几丁质酶II,以及来源于水稻的类燕麦蛋白和β-淀粉酶。高效液相色谱与傅里叶变换红外线光谱分析法分析绍兴黄酒上清蛋白质和混浊蛋白质的氨基酸组成与二级结构发现,绍兴黄酒混浊蛋白中谷氨酸含量最高,占总氨基酸含量的20.48%,疏水性的氨基酸含量比酒体蛋白高24.2%。高α-螺旋含量、低β-折叠和无规则卷曲是黄酒混浊中蛋白质的主要结构特征。

家蚕孤雌生殖差异蛋白——热休克相关蛋白的生物信息学分析

应用双向凝胶电泳(2-DE)技术研究家蚕孤雌生殖蚁蚕和正常蚁蚕的总蛋白质的差异,得到与孤雌生殖相关的差异蛋白点,并对这些蛋白点进行基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF MS)分析,获得了相关差异蛋白的序列特征。将这些序列与已构建的家蚕cDNA文库及蛋白质数据库进行比对,得到3个差异蛋白为热休克相关蛋白。通过5-′RACE的方法克隆到3个差异蛋白的全基因序列,并对它们进行结构和特征分析,有助于进一步研究其与孤雌生殖的关系。

家蚕孤雌生殖差异脂蛋白30K lipoprotein precursor基因的克隆与生物信息学分析

应用二维凝胶电泳（2-DE）技术分离家蚕孤雌生殖蚁蚕总蛋白，并和正常蚁蚕总蛋白进行比较，得到46个可能与家蚕孤雌生殖相关的差异蛋白点。对这些差异蛋白点进行胶内酶解后基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱（MALDI-TOF-TOFMS）分析，经数据库搜索鉴定，确定其中一个差异蛋白点为脂蛋白30Klipoprotein precursor（30KLPP）。通过5′-RACE技术克隆到30KLPP脂蛋白的全长cDNA序列。生物信息学分析显示该差异蛋白基因全长917bp。编码261个氨基酸，理论分子质量为30．013kD，等电点为7．193；结构域和三级结构预测显示该蛋白包含1个Lipoprotein_11结构域和12个β-折叠。预测其信号肽概率为1．000，定位在1～20aa区域，即可能存在信号肽。细胞定位预测显示该蛋白可能分泌到胞外（SP值为0．934）。分析结果有助于进一步研究30KLPP脂蛋白结构与功能的关系。

PCR-核酸飞行时间质谱系统检测新型冠状病毒方法的建立及应用研究

背景新型冠状病毒肺炎(COVID-19)在全球暴发,实验室检测结果是疾病诊断的重要依据,检测方法的灵敏度和特异度是影响实验结果的关键因素,现实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)核酸检测方法是COVID-19确诊的通用方法,但其检测灵敏度有方法局限性,依赖标本病毒含量。通过对PCR-核酸飞行时间质谱检测方法的优化,从而提高对低新型冠状病毒(SARS-CoV-2)含量病例检测的灵敏度,可为现有方法做有效补充。目的应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)原理,在Clin-ToFⅡ飞行时间质谱系统上,建立PCR-核酸飞行时间质谱(PCR-TOF MS)系统检测SARS-CoV-2的方法,并评估其实际应用价值。方法2020年2—3月于上海市临床检验中心室间质评阳性样本40份、阴性样本7份,国家卫生健康委员会室间质评阳性样本41份、阴性样本33份,本实验室购买阳性质粒及稀释样本32份,健康人样本28份,空白对照超纯水5份,共186份样本作为建立PCR-TOF MS系统数据。于2020年1—2月收集安徽省内临床送检到安徽省疾病预防控制中心的疑似COVID-19患者上呼吸道样本80份(咽拭子样本55份、痰液样本25份)及健康人群样本20份(均为咽拭子样本)作为评估PCR-TOF MS系统效果的数据。建立PCR-TOF MS系统试验体系步骤,包括PCR扩增、虾碱性磷酸酶(SAP)消化、单碱基延伸和质谱检测;并基于阳性质粒优化模版量,根据186份样本检测质谱峰的信噪比(SNP)确定该方法在SARS-CoV-2检测时的判读标准。对80份疑似SARS-CoV-2样本和20份健康人群样本进行检测分析,并与实时荧光定量PCR法进行对比。结果通过对PCR-TOF MS模板条件的优化,模版量6μl时,扩增产物可获得典型的质谱峰图。建立的PCR-TOF MS反应体系可以对SARS-CoV-2核酸的开放读码框1ab(ORF1ab)基因和核壳蛋白(N)基因进行有效扩增检测。本研究PCR-TOF MS方法对临床疑似病例样本的检出率为90.00%,高于实时荧光定量PCR法的75.00%,同时,结果显示,实时荧光定量PCR法检出中含有25.00%的可疑结果,而PCR-TOF MS则无可疑结果。对于痰液和咽拭子两种样本的检出率,PCR-TOF MS法分别为100.00%和85.45%,高于荧光定量PCR法的64.00%和43.64%。阴性样本两种方法均未检出。结论通过PCR技术与飞行时间质谱技术的结合,使得检测SARS-CoV-2目标片段指数级扩大,从而提高样本的检测灵敏度。MALDI-TOF MS技术通过对离子分子量的检测分析,具有较高的准确性和特异性,同时证实了痰液样本优于咽拭子样本。该方法可作为实时荧光定量PCR法的补充和协同,在一定程度上有利于弥补假阴性的问题,从而降低临床漏诊率,提高检测效率,为疫情的研判缩短时间。

酱油酿造米曲霉AS3.951(沪酿3.042)种曲胞外蛋白谱鉴定与分析

分析米曲霉AS3.951(沪酿3.042)种曲培养过程中不同培养时间的胞外蛋白谱,确定培养时间为48h时种曲达到蛋白鉴定要求;采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOFMS)技术检测鉴定出SDS-PAGE胶图上11个蛋白条带,通过比对数据库鉴定得到8个蛋白,其中包括α-淀粉酶、淀粉糖化酶B、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶等,与已在2009年Biosci Biotechnol Biochem期刊发表的《Analysis of extra cell ular proteins of Asper gillus oryzae grown on soy sauce koji》米曲霉AS3.951大曲的分泌蛋白谱共同提供了米曲霉沪酿AS3.951在酱油制曲过程中较完整的胞外分泌蛋白谱。

激光捕获显微切割技术纯化的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞的比较蛋白质组学研究

为筛选鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)的分子标志物,采用激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection,LCM)分别从NPC组织和正常鼻咽上皮组织(normal nasopharyngal epithelial tissue,NNET)中切割纯化NPC细胞和正常鼻咽上皮细胞(normal nasopharyngal epithelial cells,NNEC),应用二维凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)分离LCM纯化细胞的蛋白质,图像分析识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾电离串联质谱(ESI-Q-TOF-MS)鉴定差异蛋白质点,Western blot检测差异蛋白cytokeratin8(CK8)在LCM纯化的NPC细胞和NNEC以及具有不同分化程度或转移潜能的4株NPC细胞中的表达,免疫组织化学检测CK8在63例NPC、28例NNET及20例颈淋巴结转移NPC组织中的表达水平.建立了LCM纯化的NPC细胞和NNEC的2-DE图谱,质谱鉴定了29个差异蛋白质,其中15个蛋白质只在NPC表达或表达明显增高,14个蛋白质在NPC中表达下调或缺失;Western blot结果显示,CK8的表达水平在NPC中较NNET明显下调,并与NPC细胞株的分化程度和转移潜能有关;免疫组织化学结果显示,CK8在NPC组织中的表达较NNET明显下调,在颈淋巴结转移NPC中的表达较原发NPC明显上调.研究结果提示,CK8与NPC分化及淋巴结转移相关,有望成为预测NPC转移和区别NPC分化程度的分子标志物.

葛根素干预肺动脉高压大鼠时钙网蛋白前体变化的研究

目的:观察正常组与野百合碱致肺动脉高压组及葛根素干预组大鼠肺组织差异蛋白质组学的变化,在蛋白质组学水平探讨葛根素抑制肺动脉高压、肺血管重建的机制。方法:制备各组模型大鼠后分别测定平均肺动脉压力(mPAP)、平均颈动脉压力(mCAP)、右心室重量比[RV/(LV+S)]%,制作光镜标本、测量肺血管重建指标(PAMT)及统计学分析,明确模型制备成功。对各组肺组织提出的总蛋白质进行双向电泳、串联质谱鉴定有差异的蛋白质并用NCBInr数据库进行检索。对鉴定的蛋白质进行分析。结果:野百合碱组与正常组比较,mPAP、[RV/(LV+S)]%、PAMT显著增高(P<0.05),提示肺动脉高压模型制备成功。葛根素干预组与野百合碱组比较,mPAP、[RV/(LV+S)]%、PAMT显著下降(P<0.05),表明葛根素可抑制野百合碱引起的肺动脉高压、肺血管重建与右心室肥大。通过双向凝胶电泳、串联质谱鉴定及数据库检索发现钙网蛋白前体在正常组表达几乎为0,在野百合碱组大量表达,而在葛根素干预组迅速下调至0水平。结论:钙网蛋白前体可能与葛根素抑制肺动脉高压形成相关,值得深入研究。

应用蛋白质组学和RNAi技术筛选鼻咽癌细胞中p53功能相关蛋白质

为了阐明鼻咽癌中高表达的p53蛋白聚集与失活的机制,高通量地检测与p53功能相关的蛋白质,首先采用RNA干扰(RNAi)技术稳定沉默鼻咽癌细胞系CNE2的p53基因表达,然后用蛋白质组技术研究稳定沉默该基因对鼻咽癌蛋白质表达谱的影响.通过对稳定干扰p53基因后鼻咽癌细胞系CNE2的蛋白质表达谱改变的研究,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析和电喷雾串联质谱(ESI-Q-TOF-MS)验证鉴定了22个差异表达蛋白质.在这些差异表达蛋白质中,有些是已经报道的p53功能相关蛋白质,如热休克蛋白27(HSP27)、异质性胞核核糖核蛋白K(hnRNPK)、14-3-3σ等,其他可能是新的p53功能相关蛋白质,如eIF4B、TPT1、hnRNPH3、SFRS1等.部分差异表达蛋白质如HSP27、14-3-3σ和GRP75经蛋白质印迹分析技术进行了验证,同时pcDNA3.1-FLAG-p53质粒转染CNE2细胞引起了HSP27、14-3-3σ表达下调,GRP75表达上调.在鼻咽癌细胞中鉴定的22个差异表达蛋白质大致可以分为5类,包括信号传导相关蛋白质、分子伴侣、与转录和翻译相关蛋白质、代谢相关蛋白和细胞结构相关蛋白质,涉及到细胞周期的调控、分子基因表达调控、细胞黏附、细胞代谢等众多事件,它们可能作为p53功能相关蛋白质,为阐明鼻咽癌中p53蛋白聚集及失活的机制提供了重要依据和线索.

双向电泳-串联飞行时间质谱对急性脊髓损伤大鼠差异蛋白质的分离鉴定

为研究急性脊髓损伤的病理和修复机制,建立了正常和急性脊髓损伤大鼠脊髓组织的双向电泳图谱,确认了16个变化3倍以上的差异蛋白斑点,其中在急性脊髓损伤组蛋白斑点表达上调的10个,表达下调的6个。利用基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)成功鉴定出16个差异蛋白质,其中,6个蛋白质是新鉴定的,2个蛋白为同一蛋白的不同修饰。除髓磷脂碱性蛋白(MBP)和中相对分子质量神经丝蛋白(NF-M)已证实与脊髓损伤密切相关外,其它蛋白与脊髓损伤的关系有待研究。

串联飞行时间质谱鉴定急性脊髓损伤大鼠针刺后的差异蛋白质

In order to explore the effect of electroacupuncture on rats with acute spinal injury,we established animal model of the spinal injury.Total proteins were extracted from spinal cord of normal rats,acute spinal injury rats and acute spinal injury rat treated by electroacupuncture,and separated by 2-DE.10 differential expressed proteins were identified by the MALDI-TOF-TOF-MS with high mass accuracy,high mascot scores and high reliability.

应用激光捕获显微切割和蛋白质组学技术筛选鼻咽癌的差异表达蛋白质

目的:筛选鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)的差异表达蛋白质,为寻找NPC的分子标志物提供科学依据。方法:采用激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection,LCM)分别从NPC组织和正常鼻咽上皮组织(normal nasopharyngeal epithelial tissue,NNET)中纯化NPC细胞和正常鼻咽上皮细胞(normal nasopharyngeal epithelial cells,NNEC),应用二维凝胶电泳(2-DE)分离LCM纯化细胞的蛋白质,图像分析识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾电离串联质谱(ESI-Q-TOF-MS)鉴定差异蛋白质点,Western印迹和组织芯片(tissue microarray,TMA)免疫组织化学验证差异蛋白鳞状细胞癌抗原1(SCCA1)在两种组织中的表达水平。结果:建立了LCM纯化的NPC细胞和NNEC的2-DE图谱,质谱鉴定了36个差异蛋白质,其中20个蛋白只在NPC表达或表达上调,16个蛋白在NPC中表达下调或缺失。Western印迹和组织芯片免疫组织化学结果显示:SCCA1在NPC中的表达水平较NNET明显下调,与比较蛋白质组学结果一致。结论:36个差异蛋白可能与NPC的发病有关,为筛选NPC分子标志物奠定了基础。

枯草芽孢杆菌B2菌株产生的表面活性素变异体的纯化和鉴定

利用 6mol LHCl沉淀枯草芽孢杆菌B2菌株的去细胞培养液 ,甲醇抽提获得脂肽类抗生素粗提物 ,过SephadexLH 2 0层析柱获得粗纯化物 ,经MALDI TOF MS检测表明B2菌株仅含有表面活性素一种脂肽类抗生素。利用HPLCSMARTSYSTEM ,将粗纯化物过 μRPCC2 C1 8层析柱对表面活性素变异体进行分离后获得纯化物。经MALDI TOF PSD MS对纯化物的结构分析表明 ,B2菌株的表面活性素变异体由 1 3、1 4和 1 5个碳原子的脂肪酸链以及L Glu L Leu D Leu L Val L Asp D Leu L

‘春甜橘’及其突变体果皮差异相关蛋白质组分析

【目的】柑橘自然芽变材料是柑橘育种的重要来源。‘明柳甜橘’(Citrus reticuiata Blancocv.Mingliutianju,MP)是从‘春甜橘’(C.reticuiata Blanco cv.Chuntianju,CP)中选育出的自然芽变品种。分析‘春甜橘’与其自然芽变‘明柳甜橘’果皮差异蛋白质,探讨导致两品种形态差异的原因。【方法】以花后12周和23周的‘明柳甜橘’和‘春甜橘’果皮为材料,采用双向电泳技术(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)分离获得野生型与突变型差异表达蛋白点,利用MALDI-TOF-MS质谱鉴定技术分析相关差异蛋白质,并进行功能注释和生物信息学分析。【结果】将提取的果皮总蛋白质经双向电泳后,分别采用硝酸银和考马斯亮蓝染色法进行蛋白质凝胶染色,均获得了清晰的2-DE电泳图。2-DE图谱经Image Master 2D软件分析表明,硝酸银染色法能检测到约1 200个蛋白点,考马斯亮蓝染色法能检测到约500个蛋白质点,从中各选取20个变化丰度2倍以上且重复性好的蛋白点进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定和数据库检索分析,共有33个蛋白质有功能注释,其中17个蛋白质在‘明柳甜橘’果皮中表达上调,16个表达下调。按照33个差异蛋白质的功能,可将其分为11类,它们分别参与糖类/能量代谢、胁迫/防御反应、核酸代谢、氨基酸代谢、转录、氮代谢、脂肪酸代谢、蛋白修饰与降解以及未知类。利用KOBAS(KEGG Orthology-Based Annotation System)在线功能分析平台对33个差异表达蛋白质进行信号通路分析,其中18个差异蛋白质有KO注释,共涉及31条信号通路,按照P值大小排列,类黄酮生物合成过程位居第一,说明该信号通路最有可能参与春甜橘芽变形成过程。【结论】综合分析‘春甜橘’和‘明柳甜橘’基因水平及蛋白质水平的差异,推测可能是由参与类黄酮生物合成过程的差异表达基因尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因和差异表达蛋白咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的差异表达导致了二者的表型差异。

番茄幼苗盐胁迫响应蛋白质组分析

采用营养液栽培,以盐敏感型番茄品种M82为试材,利用双向电泳(2-DE)研究盐胁迫处理下幼苗叶片蛋白质的表达谱,并采用基质辅助激光解析飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术进行差异蛋白质的分离及质谱鉴定。结果表明:(1)盐胁迫处理下,利用2-DE获得差异显著蛋白点20个,其中17个蛋白质点丰度上调表达,3个蛋白质点丰度下调表达。(2)通过质谱分析和蛋白质NCBInr数据库检索,共鉴定出19个差异蛋白,分别为果糖-二磷酸醛缩酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶等及3个功能未知蛋白;这些鉴定出的差异蛋白质与能量代谢、光合作用、蛋白合成、氧化还原平衡等过程相关,暗示所分离鉴定的蛋白可能参与了番茄的盐胁迫响应,为进一步研究番茄抗逆机制奠定基础。

不同转移潜能膀胱癌细胞糖组相对定量分析

膀胱癌是发生在膀胱黏膜组织上的一种恶性肿瘤,是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤,早期(非肌层浸润型膀胱癌)阶段的诊断和治疗是降低膀胱癌死亡率的最有效方式.肿瘤的发生过程与糖链表达的改变有着密切的关系,而定量分析膀胱癌发生过程中糖链的表达变化尚未有研究.本研究以2株人膀胱正常上皮细胞系(HCV29、HUCV1),1株非肌层浸润性膀胱癌细胞系(KK47),和3株浸润性膀胱癌细胞系(YTS1、J82、T24)为研究材料,应用本室建立的利用乙酰肼修饰糖链唾液酸,以及[12C6]-和[13C6]-苯胺同位素修饰糖链还原性末端技术,然后利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS),进行膀胱上皮细胞不同病理状态的糖组相对定量分析.从6株细胞中共鉴定出52种N-连接糖链结构,并定量分析了不同类型的糖链在不同细胞中的分布差异,发现唾液酸化、岩藻糖化的N-连接糖链在膀胱癌肿瘤细胞恶化过程中呈现显著升高的趋势,同时平分型糖链和高甘露糖型N-连接糖链也呈表达升高趋势,说明这些糖链结构的表达变化与膀胱癌发生关系密切,从而有助于进一步阐明膀胱癌发生过程中糖链相关的分子机理.

高恶性膀胱移行细胞癌的蛋白质组学研究及差异蛋白mortalin的表达验证

目的:寻找高恶性膀胱移行细胞癌(BTCC)和正常膀胱黏膜的差异表达蛋白,并对筛选出的有潜在应用价值的差异蛋白进行再验证,试图发现与高恶性膀胱移行细胞癌发生、进展相关的生物学标记物。方法:联合手工显微切割、双向电泳(2-DE)及基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)对高恶性膀胱移行细胞癌与癌旁相应正常膀胱移行上皮进行蛋白质的分离和鉴定。并采用半定量RT-PCR技术和免疫组织化学技术对鉴定出的差异蛋白进行再验证。结果:共鉴定出11个差异表达蛋白,其中细胞角蛋白7(CK-7)、细胞角蛋白8(CK-8)、热休克蛋白60(HSP60)、膜联蛋白Ⅴ、抑制素这5个蛋白曾在文献中报道过,其表达失调与BTCC的发生发展可能相关;其余6个蛋白,包括mortalin、14-3-3ε蛋白、蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白、膜联蛋白Ⅳ、结蛋白、微管蛋白β4,目前尚未见到与BTCC的相关报道。半定量RT-PCR和免疫组织化学染色结果显示mortalin在高恶性膀胱移行细胞癌中mRNA和蛋白表达水平均高于正常膀胱移行上皮(P<0.01)。结论:高恶性BTCC的蛋白表达谱与相应正常的膀胱移行上皮相比有明显差异,由此表明膀胱移行细胞癌的发生是一个多基因多途径参与的复杂过程。mortalin蛋白在高恶性膀胱移行细胞癌中的表达明显上调与双向电泳的结果一致,mortalin可能成为一个潜在的、有应用价值的膀胱移行细胞癌的标记物。

宫颈上皮内瘤变与正常宫颈组织差异表达蛋白分析

目的探讨蛋白质组学方法筛查正常宫颈与宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)组织中的差异表达蛋白质标志物,为研究CIN发生的分子机制及临床诊治工作提供依据。方法收集2008年8月至2009年9月间首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科收治的正常子宫颈组织因子宫肌瘤手术行全子宫切除术患者9例为对照组、CIN组织23例(其中CINⅠ7例、CINⅡ8例、CINⅢ8例)。应用二维荧光差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis,2-DDIGE)及DeCyder软件寻找差异表达蛋白质点,基质辅助激光解析飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF MS)分析差异蛋白质点,数据库搜索鉴定差异表达最明显的S100蛋白家族A9(S100 calcium-binding protein A9,S100A9),真核延长因子1α1(eukaryoticelongation factor 1-alpha-1,eEF1A1)及丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2,PKM2)3种蛋白质;应用免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)(其中正常宫颈组织10例、CINⅠ10例、CINⅡ10例、CINⅢ10例)及蛋白印记法(Western blotting)(其中正常宫颈组织12例,CINⅠ～Ⅱ12例,CINⅢ12例)进一步验证上述3种蛋白在CIN组织和正常宫颈组织的表达差异。结果获得CIN组织与正常宫颈组织2-D DIGE图,成功鉴定25个蛋白;免疫组化及蛋白印迹验证结果提示:S100A9蛋白表达于细胞质中,在CIN中表达水平高于正常组,差异有统计学意义(P=0.010);eEF1A1蛋白表达于细胞质中、PKM2蛋白表达于细胞核中,2者在CIN中表达水平均低于正常组,差异有统计学意义(P分别为0.352,0.000)。结论在正常宫颈组织与CIN组织之间存在差异蛋白质表达,S100A9蛋白可能成为辅助诊断CIN的相关标志物,PKM2蛋白可能成为抑制CIN发生的蛋白质,并可根据2种差异蛋白表达预测CIN的发生发展。