耐氟喹诺酮类药物大肠埃希氏菌基因突变的MAMA-PCR检测

采用MAMA-PCR法对72株已知突变菌株的突变情况进行了检测。结果,有2种gyrA 83位突变:TCG→TTG和TCG缺失;4种gyrA 87位突变:GAC→AAC、GAC→GGC、GAC→TAC和GAC→CAC;1种parC 80位突变:AGC→ATC以及4种parC 84位突变:GAA→AAA、GAA→GCA、GAA→GGA和GAA→GTA。采用同样的方法,对38株未知突变菌株的检测结果显示,gyrA 83、gyrA 87、parC 80和parC 84位的突变检出的正确率分别为97．4％、94．7％、81．6%和94．7％。结果表明,MAMA-PCR有望成为监测耐氟喹诺酮类药物大肠埃希氏菌的分子生物学常规方法。

鉴别MS-H疫苗株和MS野毒株的MAMA-PCR检测方法的建立与初步应用

根据Kreizinger Z等[1]已发表的研究,依据obg基因第367位和629位的核苷酸转换,我们建立了依托琼脂糖凝胶电泳(常规PCR)的错配扩增突变分析(MAMA)方法以区分ts+MS-H疫苗株、ts-MS-H再分离株以及MS野毒株。本研究对本实验室保存的客户送检的MS分离株的阳性病料,以及日常场区送检咽喉拭子MS通用引物检测的阳性样品进行MAMA-PCR扩增,用以比对各分离株目的片段的差别,建立MS-H疫苗株与MS野毒株的鉴别方法,这将为临床鸡群MS感染状态的评估提供参考依据,也为MS的净化和防控提供技术指导。

鸡肉生产链空肠弯曲杆菌的耐药性研究

目的了解鸡肉生产链(养殖场-屠宰场-市场)中空肠弯曲杆菌分离株的耐药情况。方法针对成都市及雅安市养鸡场、屠宰场和市场中分离的180株空肠弯曲杆菌,采用微量肉汤稀释法,检测鸡肉生产链中空肠弯曲杆菌对8种抗菌药物的耐药情况;采用错配扩增突变分析PCR(MAMA PCR)技术,检测137株耐环丙沙星的空肠弯曲杆菌的gyrA基因第257位突变情况,对gyrA基因突变进行分析。结果药敏试验表明,空肠弯曲杆菌分离株对环丙沙星、左氟沙星、四环素和克林霉素的耐药率较高,分别为94.44%、93.89%、91.67%和78.33%;对红霉素(20.00%)、链霉素(20.56%)、庆大霉素(17.78%)、氟苯尼考(12.22%)呈现不同的耐药率。从养殖场到市场,鸡肉生产链中空肠弯曲杆菌对上述8种抗菌药物的耐药率呈持平或上升趋势。MAMA PCR结果表明,95.62%(131/137)的环丙沙星耐药空肠弯曲杆菌在gyrA基因第257位发生点突变,10株环丙沙星敏感菌株均没有检测出gyrA基因的突变;gyrA基因耐药决定区的测序结果表明,环丙沙星耐药菌株MJF31和MJF53都在第257位碱基发生了ACA→ATA(苏氨酸到异亮氨酸)的突变,而对环丙沙星敏感的菌株JF9和JF136均未发生该类突变。结论鸡肉生产链中空肠弯曲杆菌耐药性比较普遍,对喹诺酮类药物耐药率较高,多重耐药菌株较突出,应加强对养殖场和食品源空肠弯曲杆菌耐药性的监测。

部分中国荷斯坦种公牛脊柱畸形综合征携带状况的检测和分析

本研究旨在对部分中国荷斯坦种公牛脊柱畸形综合征(Complex vertebral malformation,CVM)致病基因的携带状况进行筛查。应用错配PCR突变分析技术(PCR mismatch amplification mutation assay,PCR-MAMA)建立了针对CVM致病基因的特异性检测方法。利用PCR-MAMA法检测了154头荷斯坦种公牛,发现了24头CVM阳性个体,阳性率为15.58%。结果显示,应对中国荷斯坦种公牛进行全面的针对CVM的检测。

HBV BCP区1762/1764和1896突变位点检测新技术研究

目的:利用错配扩增和荧光PCR原理,建立一种针对HBV BCP区1762/1764和前C区1896突变位点的新型检测方法——错配扩增突变分析PCR法(MAMA-PCR),并对该方法进行临床评价。方法:a)MAMAPCR突变检测方法性能评估:以野生和突变性阳性参考品作为模板检测3次,分析该方法稳定性;将突变型和野生型质控品梯度比例混合,分析该方法检测混合感染的检测效率。b)测序法、商品化试剂盒与本方法同时检测样本并对MAMA-PCR方法做出评价。结果:MAMA-PCR 3次检测重复性良好,CV值均小于5%,且可稳定检出含1%突变含量的混合样本。132例HBV样本中,1762/1764双突变位点测序法检出67例,ARMS-PCR试剂盒检出69例,MAMA-PCR检出69例,突变检出率分别为50.8%、52.3%和52.3%;1896突变测序法检出39例,ARMSPCR试剂盒检出41例,MAMA-PCR检出42例,突变检出率分别为29.5%、31.1%和31.8%。结论:MAMA-PCR检测方法性能稳定,突变检出率高于测序法,与商用试剂盒基本一致,可用于临床乙肝患者BCP区1762/1764双突变和前C区1896突变位点的快速检测。