pNTAP-MK2真核表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立

目的构建pNTAP-MK2真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系。方法将MK2亚克隆至串联亲和纯化载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-MK2,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用脂质体PolyFect介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAPtag-MK2融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAPtag-MK2的表达及细胞内定位情况。结果重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAPtag-MK2主要分布在核内。结论成功构建pNTAP-MK2真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对MK2定位产生明显影响。