苦瓜籽蛋白MAP30的聚乙二醇化学修饰及抗肿瘤活性研究

采用硫酸铵分级沉淀、SP-Sepharose FF离子交换层析和Blue Sepharose CL-6B亲和层析获得苦瓜蛋白MAP30;采用(mPEG)2-Lys-NHS修饰MAP30;对修饰后的MAP30-PEG结合物与MAP30的抗肿瘤活性进行了比较分析。结果发现:MAP30对多数肿瘤细胞株具有明显的抑制作用,而且抑制效果在一定范围内具有剂量和时效依赖关系。但是在相同条件下,MAP30对人正常胚肺二倍体细胞株WI-38的毒性极小。MAP30和MAP30-PEG结合物对小鼠黑色素瘤(B16)、人宫颈癌细胞(Hela)和人表皮癌细胞(A431)细胞均表现出抑制作用,且这种作用在一定范围内呈时效和量效依耐性。但在相同浓度下PEG-MAP30对小鼠黑色素瘤(B16)、人宫颈癌细胞(Hela)和人表皮癌细胞(A431)的抑制作用低于MAP30,约占65%～70%左右。

MAP30苦瓜抗HIV蛋白对细胞内HBeAg表达抑制作用的定量分析

目的 :研究Mr 为 30 0 0 0的苦瓜抗HIV蛋白 (MAP30 )对 2 .2 .15细胞内HBV基因表达的抑制作用。方法 :将HBVDNA转染的人肝癌细胞株 2 .2 .15 ,在MAP30存在的情况下培养后 ,进行间接免疫荧光染色 ,用共聚焦技术定量分析细胞内HBeAg的表达。结果 :与对照组相比较 ,MAP30培养的细胞内HBeAg荧光量明显减少。结论 :MAP30对 2 .2 .15细胞内HBeAg的表达有明显的抑制作用。

重组苦瓜MAP30蛋白对大肠癌LoVo细胞凋亡的影响

目的:克隆及重组苦瓜蛋白MAP30,观察MAP30对大肠癌LoVo细胞凋亡的影响。方法:RT-PCR法克隆MAP30基因的cDNA序列,并表达、纯化MAP30蛋白;MTT法测定纯化的MAP30蛋白对LoVo细胞的生长抑制作用;彗星实验观察MAP30引起凋亡的LoVo细胞基因组的降解情况。结果:成功克隆了苦瓜蛋白MAP30基因;MAP30蛋白对LoVo细胞体外生长具有抑制作用;MAP30蛋白对LoVo细胞半数抑制质量浓度(IC50)为70.0mg/L。MAP30在体外能诱导LoVo细胞凋亡。结论:重组的苦瓜MAP30蛋白在体外能抑制LoVo细胞生长,并能诱导其凋亡。

MAP30抗乙型肝炎病毒的体外实验

目的 :探讨MAP30 (momordicaanti HIV proteinof30ku)体外抗乙型肝炎病毒 (HBV)的作用 .方法 :以HBVDNA转染的人肝癌细胞株 (HepG2 .2 .15 )为靶细胞 ,与MAP30共同温育 10d ,观察对细胞的毒性 ;用ELISA、荧光定量PCR和Southern印迹法分别检测培养上清中HBsAg ,HBVDNA和细胞内HBVDNA .结果 :MAP30能显著减少HepG2 .2 .15细胞培养上清液中HBsAg ,HBVDNA的分泌 ,在第 8日时 ,对HBsAg抑制率为 5 0 .4 9% ,HBVDNA定量 <1× 10 7拷贝·mL-1;Southern印迹法显示MAP30能抑制HBV复制中间体及共价环状闭合DNA .MAP30未发现对细胞有毒性作用 .结论 :MAP30具有较强的体外抗HBV作用 ,作为新的抗病毒植物蛋白 。

苦瓜核糖体失活蛋白MAP30基因的表达及特性分析

目的:克隆苦瓜MAP30蛋白基因的cDNA序列,并在体外进行原核表达和纯化,体外测定MAP30对镰刀菌的抑制作用并测定MAP30基因的表达模式。方法:利用RT-PCR技术扩增861 bp的苦瓜蛋白MAP30基因编码区序列,克隆至pMD18-T载体。构建苦瓜MAP30原核表达质粒pET-28a-MAP30,SDS-PAGE和Western blot检测MAP30的表达。采用镍离子亲合层析纯化MAP30,并采用真菌抑制实验检测对镰刀菌的抑制作用,Northern blot检测其表达模式。结果:克隆片段与基因库所登录的序列一致,表达的MAP30蛋白相对分子质量约为30 000,MAP30体外能抑制镰刀菌的生长,镰刀菌能诱导MAP30基因的表达。结论:MAP30基因可能参与植物早期的过敏反应并在植物的抗病中发挥重要的作用。

苦瓜MAP30蛋白基因克隆、表达及其抗肿瘤活性研究

通过PCR技术,从苦瓜总DNA中扩增出编码MAP30成熟蛋白的基因,经测序鉴定后亚克隆到原核表达载体pET 30a中,构建成带有N端6His tag的融合表达载体。表达载体用CaCl2 介导的化学转化法转化E .coliBL2 1 (DE3) ,然后利用PCR筛选阳性克隆。工程菌经1mmol/LIPTG诱导4h实现高效表达,而且在30℃时融合蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白5 6%。可溶性分析表明,该融合蛋白在大肠杆菌中主要以可溶的形式存在。重组蛋白通过Ni2 +鏊合亲和层析进行纯化,纯化蛋白占上清总蛋白37. 2 % ,发酵液产率为2 5 0mg/L。Westernblot分析表明,重组蛋白可与兔抗his tag多克隆抗体发生特异性反应。利用MTT法分析重组MAP30的细胞毒性,结果表明其对小鼠3T3和S 1 80肿瘤细胞株具有明显的抑制作用,ID50 分别约为5 0 μg/ml和3 0mg/ml,而对人正常胚肺二倍体WI 38细胞株的毒性极小。

苦瓜果实的药用和苦瓜蛋白MAP30的研究进展

苦瓜是药食同源的蔬菜,其果实中含有多种有效成分,具有降血糖、抗病毒、抗肿瘤、抗生育、抗氧化、抑菌等功能特性。文章综述了近年来国内外苦瓜及苦瓜蛋白MAP30(Momordica anti-HIV Protein of 30 ku)的研究情况,阐述了苦瓜的保健功能及其在医学领域的应用研究进展,并展望了其研究应用前景。

苦瓜MAP30基因原核表达载体的构建和PCR快速检测重组子的研究

根据已报道的序列,把苦瓜(Momordicacharantia)MAP30基因成功克隆到原核表达载体pET28a(+)中,并对PCR快速检测阳性克隆进行了研究。结果表明,直接用菌落、菌液、酚氯仿处理过的菌液,以及提取的质粒进行PCR都可以成功地筛选阳性菌落。其中,酚氯仿处理过的菌液PCR与质粒PCR的结果最接近,而且比质粒PCR简单,因此可作为方便可靠的阳性克隆筛选的新方法。

苦瓜提取物MAP30抗病毒的研究进展

苦瓜作为药食同源的植物 ,含有许多有效成分 ,其中 MA P30是近来研究比较多的一种蛋白成分。本文概述了 MAP30的提取及其氨基酸结构 ,并从 RN A N -糖苷酶活性、DN A拓扑学失活功能、HIV- 1整合酶抑制功能三个方面论述了

重组苦瓜叶蛋白MAP30诱导人食管癌细胞株EC-1.71凋亡的实验研究

目的探讨用重组苦瓜蛋白MAP30(Momordica anti-HIV protein of 30 ku)诱导人食管癌细胞株EC-1.71细胞凋亡状况。方法 MAP30诱导EC-1.71细胞后,透射电镜观察细胞凋亡的形态特征;JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位(ΔΨm)变化;ELISA法检测细胞培养上清液中细胞色素c(Cytc)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平;免疫细胞化学法检测细胞ERK1/PERK1,AKT/PAKT和NF-κB表达;荧光微板阅读仪检测细胞caspase-12活性。结果 MAP30诱导可以使EC-1.71细胞固缩,核膜扭曲,核染色质聚集成块并靠近核膜,内质网高度膨胀、扩张;ΔΨm水平下降;Cytc和TNF-α含量增加;胞质中ERK1、AKT表达增强而胞核中PERK1、PAKT表达降低,NF-κB活性降低,caspase-12活性增强。结论 MAP30可以诱导EC-1.71细胞凋亡。

不同苦瓜品种MAP30基因的克隆及序列分析

采用PCR法从精选白皮苦瓜（JX）、穗农牌早优苦瓜（ZY）、碧翠苦瓜（BC）、银田牌长白苦瓜（YT）和银田牌蓝山大白苦瓜（LAN）5个品种中克隆到5个长度均为861bp的MAP30基因JX—MAP30、ZY—MAP30、BC-MAP30（Genebank accession No：DQ643967）、YT—MAP30（No：DQ643968）和LAN-MAP03。序列分析表明，BC-MAP30和YT-MAP30与已报道的MAP30基因分别存在2个和3个碱基的不同，均编码263个氨基酸残基组成的成熟蛋白，与其他葫芦科植物的Ⅰ型核糖体失活蛋白类以及天花粉毒蛋白、多花白树毒蛋白、肥皂草毒素的同源性分别为68．90％、82．75％、71．25％和66．45％，其90～220位氨基酸序列较为保守。二级结构预测表明，BC—MAP30和YT—MAP30编码的成熟肚在N端均有一个延伸的6个β片层。

苦瓜蛋白MAP30通过AKT/mTOR通路促进多发性骨髓瘤细胞的自噬和凋亡

目的:探讨苦瓜蛋白MAP30在多发性骨髓瘤中的作用及其机制。方法:将人骨髓瘤RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞为靶细胞,以不同浓度(1～10μmol/L)的MAP30处理后,采用CCK-8法检测多发骨髓瘤细胞株RPMI-8226、NCI-H929和U266的增殖能力,Annexin V/PI流式细胞术检测骨髓瘤细胞的凋亡情况,Wb实验检测骨髓瘤细胞凋亡相关蛋白(PARP)、自噬相关蛋白(LC3II、P62)及AKT/mTOR通路相关蛋白的表达水平,CCK-8法、流式细胞术和Wb实验检测MAP30联合自噬激动剂雷帕霉素(Rap)或自噬抑制剂巴弗洛霉素(Baf)作用后骨髓瘤细胞增殖、凋亡和自噬的变化。结果:MAP30(1～10μmol/L)抑制骨髓瘤细胞的增殖,且其对增殖的抑制呈时间和剂量依赖关系(P<0.05或P<0.01)。MAP30单独作用骨髓瘤细胞后,细胞凋亡和细胞自噬增加,PARP裂解增多,LC3II表达水平增加,P62表达明显下降(均P<0.05或P<0.01);MAP30+Rap作用骨髓瘤细胞后,较单用MAP30细胞增殖率增加、细胞凋亡率减少、细胞自噬减少、PARP裂解降低、LC3II表达降低及P62表达增加(均P<0.05或P<0.01);相反,MAP30+Baf作用骨髓瘤细胞较单用MAP30,细胞增殖率减少、细胞凋亡率增加、细胞自噬增加、PARP裂解增加、LC3II表达增加、P62表达降低(均P<0.05或P<0.01);MAP30作用骨髓瘤细胞后,AKT/mTOR通路相关蛋白p-AKT和p-mTOR表达水平明显降低(均P<0.05)。结论:MAP30可通过AKT/mTOR通路促进骨髓瘤细胞的凋亡和自噬,可能为骨髓瘤的治疗提供新的治疗策略。

苦瓜MAP30蛋白研究现状及应用前景分析

苦瓜MAP30蛋白属于Ⅰ型核糖体失活蛋白,具有广谱的抗病毒、抗肿瘤活性,并且具有良好的特异性,对正常细胞无毒副作用。总结了MAP30蛋白结构、抗病毒活性、抗肿瘤活性及相关机制,并对其应用前景进行了分析,为进一步深入研究MAP30蛋白抗病毒、抗肿瘤机制及开发相关药物提供科学依据和理论基础。

MAP30蛋白结构功能的生物信息学研究

使用protparam、PHDhtm、PredictProtein等生物信息学在线服务器,对MAP30蛋白进行全面分析预测,研究MAP30蛋白具有的抗HIV活性,为临床应用提供抗科学依据和理论基础。结果表明:MAP30蛋白为稳定的碱性疏水蛋白,序列上存在三段跨膜螺旋结构和一段无序化位区域,肽链上的二硫键可使分子间形成聚集体,是一种分泌蛋白。MAP30蛋白序列包含信号肽、低复杂度区域和RIP样活性区域3个区域,具有细胞外被膜、异构酶、免疫应答三种功能。序列上分布着N-糖基化位点、N-豆蔻酰化位点、Shiga/ricin核糖体失活蛋白活性位点和多段蛋白激酶磷酸化位点。

苦瓜MAP30蛋白功能区段缺失体构建及其生物活性研究

通过PCR技术从质粒pET30a-MAP30中分别得到编码M1(D1-K195)、M2(D1-E187)、M3(A11-K195)、M4(A11-E187)4个功能区段缺失体蛋白的序列,经测序鉴定后亚克隆到原核表达载体pET22b中,表达载体用CaCl2介导的化学转化法转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,然后利用菌落PCR筛选阳性克隆。工程菌在28℃时经1mmol/LIPTG诱导5h时实现高效表达,4种重组蛋白在大肠杆菌中都以包涵体形式存在。利用MTT法分析4个重组蛋白复性液的抗肿瘤活性,结果表明4个功能区段缺失体重组蛋白均对人羊膜细胞系wish、鼠髓白血病细胞系NFS-60、小鼠腹水瘤细胞S-180有杀伤作用,其中对鼠髓白血病细胞系NFS-60抑制作用最明显。M1、M2、M3和M44个缺失体重组蛋白对NFS-60作用的IC50分别为2.51、2.42、1.89μg/ml和1.90μg/ml。细胞毒性分析表明,4个重组蛋白对人正常肝细胞系HL-70的细胞毒性极小,且都低于重组MAP30蛋白的细胞毒性。

苦瓜MAP30基因的克隆表达及对BGC-823细胞形态的影响

目的:克隆苦瓜蛋白MAP30基因,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,初步研究MAP30蛋白对BGC-823细胞的影响。方法:应用PCR技术从苦瓜基因组中扩增出MAP30基因片段,将其TA克隆和双酶切鉴定,再进行测序分析,并构建重组表达载体pET-28a-MAP30,转化到表达菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,用NTA-Ni2+树脂分离纯化所表达的MAP30融合蛋白,并经SDS-PAGE电泳鉴定;纯化的蛋白作用于BGC-823细胞后通过光镜和电镜进行形态学观察。结果:成功扩增出MAP30基因为861bp,与基因库中公布的DQ643967同源性为100%,与DQ643968和S79450的同源性为99%;成功构建pET-28a-MAP30原核表达重组质粒;通过NTA-Ni2+树脂分离纯化目的蛋白,获得原核表达的大小约为30000的MAP30融合蛋白,与预测一致;蛋白作用细胞后,细胞形态有明显变化。结论:成功构建pET-28a-MAP30表达载体并获得原核表达的MAP30融合蛋白;重组MAP30蛋白能引起BGC-823细胞明显的形态学变化。

苦瓜蛋白MAP30对大肠癌细胞株LoVo细胞生长及凋亡的影响

目的:观察苦瓜蛋白MAP30对大肠癌细胞株LoVo细胞生长及凋亡的影响。方法:采用MTT比色法分别观察20、40、60、80和100mg/LMAP30处理48h及40mg/LMAP30处理24、36、48和72h对LoVo细胞生长的影响,计算细胞生长抑制率。采用流式细胞仪检测40mg/LMAP30处理24h对LoVo细胞凋亡的影响。采用Northern blot和Western blot分别检测40mg/LMAP30作用于LoVo细胞0～120h,细胞bcl-2和bax基因和蛋白的表达。结果:MAP30可呈剂量、时间依赖性抑制LoVo细胞的生长(F=128.3,107.5,P<0.05),促进LoVo细胞凋亡(F=92.7,P<0.05)。MAP30还可上调Bax基因与蛋白表达,下调Bcl-2基因与蛋白的表达。结论:MAP30可影响LoVo细胞Bcl-2和Bax的表达,从而诱导细胞凋亡,抑制细胞生长。

MTT比色法检测苦瓜MAP30蛋白对5637细胞增殖、MALAT1、HOTAIR及UCA1的影响

目的探讨噻唑蓝(MTT)比色法检测苦瓜MAP30蛋白对5637细胞增殖、肺腺癌转移相关转录因子1(MALAT1)、长链非编码RNA HOX转录反义RNA(HOTAIR)基因及尿路上皮癌相关1(UCA1)的影响。方法按MTT法的相关操作原则与相关流程提取膀胱癌患者的苦瓜MAP30蛋白后进行克隆、表达及纯化处理,接着提取其处理膀胱癌5637细胞并进行MTT检测。探析苦瓜MAP30蛋白对5637细胞增殖和对MALAT1、HOTAIR及UCA1表达的相关性。结果抑制率:膀胱癌5637细胞增殖时所产生的抑制率越高时,MAP30蛋白浓度也越高,且时间越长,即MAP30蛋白浓度与膀胱癌5637细胞增殖呈正比(P<0.05)。凋亡率:膀胱癌5637细胞凋亡随MAP30浓度递增而逐渐上升,且MAP30浓度(培养48 h)为400μg/mL时,膀胱癌5637细胞凋亡率达到最高,MAP30浓度与膀胱癌5637细胞凋亡呈正比(P<0.05)。膀胱癌5637细胞lncRNA MALAT-1、HOTAIR、UCA1表达水平随苦瓜MAP30蛋白浓度的递增而逐渐降低,检测时间为48 h且苦瓜MAP30蛋白浓度为400μg/mL时上述三项指标的表达水平均显著低于48、24 h的其他苦瓜MAP30蛋白浓度(P<0.05)。结论苦瓜MAP30蛋白对膀胱癌5637细胞增殖的抑制和凋亡诱导方面有较好的效果,且可下调MALAT-1、HOTAIR、UCA1表达水平。

苦瓜MAP30基因克隆及其引物设计

根据Lee HuangS报道的序列 ,进行苦瓜MAP30的克隆 .设计的三对引物聚合酶链反应都能扩增出特异的条带 ,测序结果表明克隆成功 .并结合实际对引物设计进行了讨论 .

新型抗病毒抗肿瘤苦瓜蛋白MAP30的研究进展

综述国内外有关苦瓜蛋白MAP30(Momordica anti-HIV protein of 30 kD)的结构、药理作用、作用机理、重组生产等方面的研究进展。