沉默MAP4K4通过调控PPARγ/ABCA1通路缓解ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAP4K4)在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管内皮细胞损伤中的作用及其机制。方法采用100 mg/L ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)建立细胞损伤模型。RT-PCR检测HUVEC中MAP4K4的mRNA表达水平。Western blot法测定MAP4K4、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3(C-Caspase-3)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)蛋白表达量。CCK8法检测细胞存活率。ELISA试剂盒检测细胞凋亡。DCFH-DA用于检测细胞活性氧(ROS)水平。丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性分别用其试剂盒进行检测。结果ox-LDL能明显上调MAP4K4的表达。另外,沉默MAP4K4能够显著增加细胞活性,且抑制ox-LDL诱导的细胞凋亡;同时可抑制Bax和C-Caspase-3的蛋白表达并促进Bcl-2的蛋白表达量。此外,下调MAP4K4能够明显抑制ROS生成及MDA含量,并增加抗氧化酶SOD和CAT活性。机制研究显示沉默MAP4K4能够激活PPARγ/ABCA1信号通路。结论沉默MAP4K4通过激活PPARγ/ABCA1信号通路抑制ox-LDL诱导的HUVEC细胞凋亡和氧化应激从而减轻血管内皮细胞损伤,为治疗As提供理论依据。

SASH1通过MAP2K2和MAP4K4与ERK信号通路交互作用

目的探讨新候选抑癌基因SASH1与细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路的两个关键分子MAP2K2和MAP4K4的蛋白-蛋白相互作用关系。方法用XhoⅠ和HpaⅠ构建SBP-Flag-SASH1-p BABE-puro反转录病毒载体,转染HEK-293T细胞,通过嘌呤霉素筛选出稳定表达外源性SASH1基因的细胞系。Western blot检测外源性Flag-SASH1蛋白表达,利用pull-down实验、质谱技术、免疫沉淀鉴定和分析与SASH1结合的并可能调节细胞增殖、转移和凋亡等的关键蛋白。用SASH1-siRNA1和SASH1-siRNA2分别转染MDA-MB-231细胞系,以空白组和Negative-siRNA组为对照。72 h后Western blot检测SASH1的干扰效果和P-ERK1/2水平。结果成功构建稳定表达SBP-Flag-SASH1-p BABE-puro重组质粒的HEK-293T细胞系,SASH1与MAP2K2和MAP4K4结合并发生相互作用。SASH1-siRNA有效抑制MDA-MB-231细胞SASH1蛋白表达(P<0.05),且P-ERK1/2在SASH1抑制组表达增加。结论 MAP2K2和MAP4K4是SASH1的重要的候选结合蛋白,SASH1可能通过与其直接或间接结合串话ERK信号传导通路,进而调节细胞增殖和迁移等细胞生物学功能。

MAP4K4对肝癌细胞生物学活性的影响及机制

目的检测MAP4K4对肝癌细胞生物学活性的影响并初步探讨其作用机制。方法选取四种肝癌细胞(Hep3B,HepG2,SMMC7721,Huh-7)采用实时定量PCR和Western blot方法分别检测MAP4K4 mRNA和蛋白水平的表达。设计靶向MAP4K4的特异性siRNA核苷酸序列质粒转染组及空载体质粒转染组,用Lipofectamine 2000法分别转染到MAP4K4蛋白表达活性最强的肝癌细胞,QRT-PCR和Western blot方法检测干扰效率,并对转染后肝癌细胞进行WST-8细胞增殖实验,平板克隆形成实验,PI染色法细胞周期检测,Annexin V法细胞凋亡检测;对干扰组及对照组细胞进行基因芯片检测,以进一步探究MAP4K4基因在肝癌细胞中可能的作用机制。结果 MAP4K4在各细胞株的表达依次为:HepG2>Hep3B>Huh-7>SMMC7721;MAP4K4的干扰效率达50%以上;MAP4K4基因敲减后细胞生长减慢;平板克隆形成能力减弱;细胞周期阻滞于S、G2期;细胞凋亡明显增加;MAP4K4基因敲减后,其上游的基因:TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、MyD88、IRAK、TRAF6、TIRAP的表达明显下调,下游基因TAK1(MAP3K7)和MKK3的表达也明显下调。结论 MAP4K4基因敲减可以阻滞细胞周期的进程,抑制肝癌细胞的恶性增殖,其机制可能是通过NF-κB信号转导途径、JNK信号转导途径发挥作用。

MAP4K4在肝细胞癌中的表达及意义

目的探讨MAP4K4蛋白在肝细胞癌中的表达及临床病理学意义。方法用400例肝细胞癌蜡块标本构建肝细胞癌组织芯片,采用免疫组织化学技术检测MAP4K4蛋白在含400例配对肝细胞癌及癌旁组织的表达,并分析不同临床病理参数中MAP4K4蛋白表达水平的差异。结果在正常肝、肝炎和肝硬化组织中MAP4K4呈一致阴性或弱阳性表达,周围结缔组织、血管和胆管无MAP4K4阳性着色,Kuffer细胞和淋巴细胞生发中心可见阳性染色;异型增生结节的肝细胞中MAP4K4的表达明显强于正常肝、肝炎和肝硬化组织,肝细胞癌组织中MAP4K4表达显著增强,其中过度表达194例(48.5%),灶性阳性或阴性206例(51.5%);HBsAg阳性患者MAP4K4阳性率51.5%(157/305)显著高于阴性患者的38.8%(37/95)(P=0.033),肿瘤直径≤2cm的MAP4K4阳性率为31.6%(18/57)显著低于肿瘤直径>2cm的51.3%(176/343)(P=0.006),MAP4K4在不同组织学分级中的阳性率差异有统计学意义(P<0.001),肝内转移病例的MAP4K4阳性率为55.5%(152/274)显著高于未转移者的33.3%(42/126)(P=0.002),MAP4K4表达在患者年龄、血清甲胎蛋白浓度、肝硬化、包膜浸润方面差异无统计学意义。结论 MAP4K4在肝细胞癌组织中高表达,并且其表达水平与HBV感染状态、肿瘤大小、组织学分级及转移情况可能有一定关系。

MAP4K4在肌层浸润性膀胱癌的表达及与其预后的关系

目的研究MAP4K4在肌层浸润性膀胱癌中的表达及其与肌层浸润性膀胱癌预后的相关性。方法对156例肌层浸润性膀胱癌蜡块切片,采用免疫组织化学技术检测MAP4K4蛋白在156例肌层浸润性膀胱癌组织的表达活性,分析MAP4K4蛋白表达与不同临床病理参数之间的相关性。通过Log-rank检验及COX回归分析判断MAP4K4的表达与预后的相关性。结果MAP4K4在肌层浸润性膀胱癌中的表达量与其淋巴血管侵犯、淋巴结转移、多发肿瘤及病理分期相关。单因素分析显示:MAP4K4的表达与肌层浸润性膀胱癌患者的预后显著相关,COX回归分析显示,在淋巴结阴性的68例肌层浸润性膀胱癌中,MAP4K4高表达与预后不良显著相关。结论 MAP4K4在肌层浸润性膀胱癌中表达水平与预后显著相关,是一个具有重要临床相关性的基因。

MAP4K4沉默表达对结肠癌细胞生物学特性的影响

目的分析沉默丝裂原活化蛋白激酶-激酶激酶4(MAP4K4)对结肠癌细胞生物学行为的影响。方法脂质体siRNA干扰技术转染人结肠癌细胞SW620细胞株,按转染情况分为MAP4K4干扰组(转染MAP4K4-siRNA 1.5 mL)、空载体组(转染无关siRNA 1.5 mL)、空白对照组(不予细胞转染处理)。分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法(WB)测定各组MAP4K4 mRNA及蛋白表达,并检测各组SW620细胞增殖、侵袭及细胞凋亡情况。结果①空载体组与MAP4K4干扰组MAP4K4 mRNA、蛋白浓度低于空白对照组(P<0.05),MAP4K4干扰组MAP4K4 mRNA、蛋白浓度低于空载体组(P<0.05);②MAP4K4干扰组不同时间增殖活性均低于空载体组和空白对照组(P<0.05);③MAP4K4干扰组穿膜细胞比率低于空载组和空白对照组(P<0.05),空载体组穿膜细胞比率低于空白对照组(P<0.05);④MAP4K4干扰组细胞凋亡率高于空载组和空白对照组(P<0.05),空载体组细胞凋亡率高于空白对照组(P<0.05)。结论siRNA干扰技术沉默结肠癌细胞MAP4K4表达可降低结肠癌细胞增殖及侵袭能力,促进癌细胞凋亡,或可能为结肠癌防治的新靶点。

小菜蛾MAP4K4基因上游5′-侧翼序列克隆与结构分析

本实验室前期研究表明,小菜蛾通过有丝分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号途径上游转录激活的关键基因MAP4K4反式调控多个中肠受体基因的表达,从而介导其对苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)产生的Cry1Ac杀虫蛋白的高抗性。为进一步明确MAP4K4基因转录激活而过量表达的顺式调控机制,本文利用小菜蛾基因组数据库中MAP4K4基因序列信息,首先克隆了Bt Cry1Ac敏感小菜蛾种群MAP4K4基因上游5′-侧翼序列,得到了两种不同形式的5′-侧翼序列:MAP4K4-1和MAP4K4-2。随后,预测分析了其中的潜在功能顺式作用元件,同时发现其中核苷酸的转换会导致顺式作用元件的改变。本研究初步揭示了小菜蛾MAP4K4基因的5′-侧翼序列的遗传多样性,为后续明确MAP4K4的顺式调控机制奠定了基础。

MAP4K4在胰腺癌中的表达及增殖功能的研究

目的:检测丝裂原激活蛋白激酶4(MAP4K4)在胰腺癌中的表达及意义,并研究其对胰腺癌细胞增殖功能的影响。方法:检索GEPIA和Oncomine数据库,分析MAP4K4在胰腺癌以及正常胰腺组织中的表达;检索GEPIA和Onco Lnc数据库,分析MAP4K4的表达量与胰腺癌患者生存期之间的关系。免疫组化检测MAP4K4在人胰腺癌及癌旁组织中的表达并分析其与胰腺癌患者临床病理参数的相关性以及生存分析。q RT-PCR和Western blot检测MAP4K4在人胰腺癌细胞株中的表达。慢病毒感染人胰腺癌细胞株CFPAC-1和MIA Pa Ca-2构建MAP4K4过表达及干扰细胞株,CCK-8和克隆形成实验研究其增殖能力变化。结果:GEPIA和Oncomine数据库显示MAP4K4在人胰腺癌中的表达显著高于正常胰腺组织(P<0.01)。GEPIA和On-co Lnc数据库表明胰腺癌中高表达MAP4K4组患者的总体和无病生存期显著低于低表达组患者(P<0.01)。免疫组化表明MAP4K4在人胰腺癌组织中的表达高于癌旁组织并与肿瘤大小、肿瘤分化相关(P<0.05),生存分析提示MAP4K4高表达的胰腺癌患者生存时间显著低于MAP4K4低表达的患者(P<0.05)。MAP4K4过表达及干扰胰腺癌细胞株构建成功,过表达后胰腺癌细胞株增殖能力明显增加而干扰后显著降低(P<0.05)。结论:MAP4K4在胰腺癌中表达增高并与预后负相关,且促进胰腺癌细胞增殖。

SOX2与MAP4K4在乳腺癌组织中的表达及临床意义

目的探讨SOX2与MAP4K4蛋白在乳腺癌组织中的表达及其可能的机理、相互作用以及与乳腺癌发生、发展、预后的关系。方法应用免疫组化SP法检测60例乳腺癌组织和30例乳腺纤维瘤组织中SOX2与MAP4K4蛋白的表达情况,并分析其与乳腺癌临床病理特征和预后的关系。结果 60例乳腺癌组织中,SOX2和MAP4K4的阳性表达率是68.3%(41/60)和78.3%(47/60),两者的表达与肿瘤的分化程度及T、N和M分期相关(P<0.05);SOX2与MAP4K4在乳腺癌中的表达明显高于乳腺纤维腺瘤组织,差异有统计学意义(P<0.05);相关性分析显示:乳腺癌中的SOX2的表达随MAP4K4表达强度的增强而升高,呈正相关(r=0.415,P=0.045)。30例乳腺纤维腺瘤组织中,有4例SOX2表达阳性,有2例MAP4K4表达阳性。结论 SOX2与MAP4K4蛋白的表达可能与乳腺癌的发生发展和侵袭转移相关,并可作为评价乳腺癌生物学行为和预后的重要指标。SOX2与MAP4K4蛋白两者可能在乳腺癌的发生发展中起重要的协同作用。

MAP4K4促进肺腺癌恶性生物学行为的实验研究

目的 探究丝裂原激活蛋白激酶4(MAP4K4)对肺腺癌恶性生物学行为的影响。方法 使用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)分别检测肺腺癌患者和健康志愿者肺组织中MAP4K4的表达情况;通过Westernblot方法确定MAP4K4蛋白在肺腺癌患者中的表达情况,并筛选MAP4K4高表达细胞系作为研究对象,通过慢病毒转染沉默/上调细胞MAP4K4蛋白表达,分析MAP4K4基因对肺腺癌细胞的增殖作用;采用transwell小室实验,检测MAP4K4基因对肺腺癌细胞的侵袭能力的影响;利用Westernblot方法检测上调/沉默MAP4K4蛋白表达,对下游信号蛋白c-Jun氨基末端激酶/磷酸化c-Jun氨基末端激酶(JNK/p-JNK)、蛋白激酶/磷酸化蛋白激酶(Erk/p-Erk)、人基质金属蛋白酶2(MMP-2)、人基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达的影响。结果 肺腺癌患者的癌变组织样本MAP4K4蛋白表达量高于健康人群组织样本(P <0. 05);对多种肺腺癌细胞系分析发现H1795细胞的MAP4K4表达量最高;MTT结果显示上调MAP4K4表达,H1795细胞增殖能力升高,同时细胞的侵袭能力明显提升,MMP-2、MMP-9、p-Erk和p-JNK蛋白表达显著增加;而沉默MAP4K4基因能获得相反的结果。结论 MAP4K4通过调控JNK和Erk信号通路蛋白,并上调MMP-2、MMP-9蛋白表达量,促进肺腺癌的恶性生物学行为。

乳腺癌组织中SOX2、MAP4K4表达水平研究

目的观察SOX2、MAP4K4在乳腺癌组织中的表达水平。方法选取自2016年2月至2018年2月北京市垂杨柳医院收治的89例乳腺癌患者为研究对象。分别取患者的乳腺癌组织和癌旁正常组织,采用免疫组织化学法检测乳腺不同组织中SOX2、MAP4K4的表达情况。结果乳腺癌组织中的SOX2、MAP4K4阳性率分别为59. 6%(53/89)、64. 0%(57/89),明显高于正常组织的12. 7%(11/89)、10. 1%(9/89),差异有统计学意义(P <0. 05)。有淋巴结转移的乳腺癌组织中的SOX2、MAP4K4阳性率分别为76. 9%(40/52)、80. 8%(42/52),明显高于无淋巴结转移的乳腺癌组织中的35. 1%(13/37)、40. 5%(15/37),差异有统计学意义(P <0. 05)。结论 SOX2、MAP4K4在乳腺癌组织,尤其是在有淋巴结转移的乳腺癌组织中高表达,即两者可能与乳腺癌的发生、发展、转移密切相关。

建立稳定敲减MAP4K4表达的A549细胞系及初步分析

目的分析敲减MAP4K4表达对癌细胞增殖及迁移运动的影响,并探究潜在的分子机理。方法构建稳定敲减MAP4K4表达A549细胞,并综合免疫荧光、细胞增殖与迁移运动等实验方法,检测其亚细胞定位,并分析对照组与敲减组细胞增长及迁移运动变化情况。结果A549细胞中MAP4K4定位于黏着斑及细胞边缘部位,稳定敲减MAP4K4表达诱导癌细胞成簇生长,阻滞细胞周期进程及细胞迁移运动。进一步分析发现,敲减MAP4K4表达诱导E-cadherin积累而下调N-cadherin,扰乱“钙黏蛋白转换”及上皮-间质转换。最终,对照组与敲减组细胞分别联合顺铂(终浓度为5μmol/L)及紫杉醇(终浓度为20 nmol/L)处理,稳定敲减MAP4K4表达可明显增强化疗药物对癌细胞的杀伤效果。结论A549细胞中MAP4K4可通过调控“钙黏蛋白转换”促上皮-间质转化而调控癌细胞恶性表型及化疗耐药。

蜂胶中CAPE对HGF诱导的HepG2细胞侵袭和迁移能力的抑制作用

目的:探讨咖啡酸苯乙酯(phenethyl caffeate,CAPE)对肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)诱导的人肝癌细胞系(Hep G2细胞)侵袭和迁移的抑制作用及机制。方法:将实验分为对照组(HGF=0 ng/m L;CAPE=0μmol/L)、诱导组(HGF=20 ng/m L;CAPE=0μmol/L)和荷药组(HGF=20 ng/m L;CAPE分别为2.5、5.0、7.5、10.0μmol/L),测定细胞黏附率,Transwell小室模拟细胞侵袭和迁移能力以及划痕实验测定细胞迁移率,蛋白免疫印迹(Western blot)法检测ELMO1、MAP4K4和FNDC3B表达。结果:与对照组比较,诱导组表现出显著的促进细胞黏附和迁移作用,荷药组中表现出对HGF诱导的细胞黏附和迁移具有显著的抑制作用(P<0.05)。Transwell小室实验结果表明CAPE对HGF诱导的Hep G2细胞侵袭和迁移作用有抑制作用。Western blot结果显示,诱导组和对照组相比ELMO1和MAP4K4表达显著上调,荷药组和诱导组相比ELMO1和MAP4K4表达显著下调(P<0.05);诱导组表达FNDC3B较对照组显著下降(P<0.05),荷药组FNDC3B表达量较诱导组增加,但结果不显著(P>0.05)。结论:CAPE能够抑制HGF诱导的Hep G2细胞的黏附、侵袭和迁移。CAPE通过上调FNDC3B和下调ELMO1、MAP4KE的表达,抑制Hep G2细胞的侵袭和迁移能力。

let-7a通过抑制MAP4K3/MKK4/JNK信号通路减少脑出血大鼠神经元调亡

目的:研究微小RNA let-7a对脑出血(ICH)大鼠神经元凋亡的影响及其分子机制。方法:从48只健康SD大鼠中随机选取8只作为假手术组,将2μLⅦ型胶原酶注入其余大鼠苍白球以构建ICH模型。将造模后的大鼠随机分为模型(2μL生理盐水)组、let-7a激动剂(agomir)组、阴性对照(NC)agomir组、let-7a拮抗剂(antagomir)组和NC antagomir组,每组8只,在侧脑室注射相应药物。7 d后进行神经功能评分;HE染色观察病理损伤;RT-qPCR和Western blot检测相关蛋白表达水平;TUNEL染色检测神经元凋亡情况;利用生物信息学软件预测let-7a与丝裂原活化的蛋白激酶激酶激酶激酶3(MAP4K3)的靶向关系,并在HEK293T细胞中用双萤光素酶报告基因实验进一步验证。结果:动物实验中,let-7a过表达时,神经功能评分降低,病理损伤减轻,胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)低表达,神经元凋亡减少,cleaved caspase-3和cleaved PARP低表达(P<0. 05)。细胞实验中,MAP4K3是let-7a的靶基因之一,且两者为负向调控;let-7a过表达抑制MAP4K3/MKK4/JNK的表达。结论:let-7a通过抑制MAP4K3/MKK4/JNK信号通路,减少ICH大鼠神经元凋亡。