灰树花多糖联合顺铂对肺癌模型小鼠p38 MAPK/ATF2信号通路调控作用的实验研究

目的 观察顺铂联合灰树花多糖对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用,并阐述其抑制p38/ATF2信号通路过表达的作用机制.方法 45 只小鼠随机分为3组,模型对照组(n=15),顺铂组(n=15),顺铂联合灰树花组(n=15).3组小鼠均经左腋下皮下注射Lewis细胞悬液0.2 mL,即每只小鼠接种细胞数为105 个.1 周后观察成瘤情况并开始对顺铂组和顺铂联合灰树花组进行相应药物干预,连续2 周.末次给药后,处死小鼠,测量肿瘤组织重量,以及瘤组织中p38、p-p38、ATF-2的表达水平.结果 与模型对照组比较,顺铂组及顺铂联合灰树花组小鼠肿瘤重量显著减轻,肿瘤组织中p38、p-p38、ATF-2的表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);与顺铂组比较,顺铂联合灰树花组小鼠瘤重显著减轻,瘤组织中p38、p-p38、ATF-2的表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.01).结论 顺铂与灰树花多糖联合应用,对Lewis种植瘤小鼠模型具有明显的抑瘤作用,其作用机制可能是通过抑制p38/ATF2信号的过度活化而实现的.

黑逍遥散调控p38MAPK/ATF2/COX-2信号通路对阿尔茨海默病大鼠神经炎症的影响

目的 观察黑逍遥散对Aβ_(1-42)所致阿尔茨海默病(AD)大鼠学习记忆能力的影响,并从p38MAPK/ATF2/COX-2信号通路介导的炎症级联反应探讨其作用机制。方法 双侧海马注射1μL Aβ_(1-42)溶液复刻AD大鼠模型。筛选造模成功的大鼠50只,随机分为模型组、盐酸多奈哌齐组(0.5 mg/kg)和黑逍遥散低、中、高剂量组(4.25、8.5、17 g/kg),连续给药42 d。Morris水迷宫实验检测定位航行与空间探索能力,HE染色观察海马神经元病理结构改变,ELISA法检测海马组织Aβ_(1-42)、iNOS、PGE_(2)表达,RT-qPCR法检测海马组织p38、ATF2、COX-2 mRNA表达,Western blot法检测海马组织p-p38、p-ATF2、COX-2蛋白表达。结果 与模型组比较,黑逍遥散中、高剂量组和盐酸多奈哌齐组逃避潜伏期缩短(P<0.01),有效区域运动距离、目标象限滞留时间百分比增加(P<0.01),海马CA1区神经元排列有序,胞体清晰,凋亡细胞减少,海马组织Aβ_(1-42)、iNOS、PGE_(2)水平降低(P<0.05,P<0.01),p38、COX-2 mRNA表达降低(P<0.05,P<0.01),p38、p-p38、p-ATF2、COX-2蛋白表达降低(P<0.01)。结论 黑逍遥散可改善Aβ_(1-42)所致AD大鼠的认知能力,其机制可能与阻断p38MAPK/ATF2/COX-2信号通路传导,进而减轻炎症反应有关。

叶酸通过JNK/p38 MAPK信号通路调节小鼠C2C12成肌细胞分化

目的:观察叶酸(folic acid,FA)对小鼠C2C12成肌细胞增殖和分化的影响并探讨其作用机制。方法:(1)在小鼠C2C12成肌细胞增殖阶段,采用不同浓度(0、2.5、5、10和20μmol/L)的FA处理C2C12细胞,显微镜下观察各组细胞的状态,MTT法检测细胞活力,EdU法检测细胞增殖情况。(2)在小鼠C2C12成肌细胞分化阶段,将细胞分为对照(control,Ctrl)组(0μmol/L FA)和FA组(10μmol/L FA),于分化的第2天和第4天,采用免疫荧光染色和Western blot检测成肌细胞分化相关蛋白成肌细胞决定蛋白1(myoblast determination protein 1,MyoD)、成肌蛋白(myogenin,MyoG)和肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)的表达水平,并统计各组细胞肌管形成情况。(3)在小鼠C2C12成肌细胞分化第4天时,加入FA处理0、1、3和6 h,采用Western blot检测各时点c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化JNK(phosphorylated JNK,p-JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和磷酸化p38 MAPK(phosphorylated p38 MAPK,p-p38 MAPK)蛋白水平。(4)将分化4 d的小鼠C2C12成肌细胞分为Ctrl组、FA组、SP600125(JNK特异性抑制剂)组、SB2035805(p38 MAPK特异性抑制剂)组、FA+SP600125组和FA+SB203580组。C2C12成肌细胞先接受10μmol/L的SP600125或SB203580处理1 h,再经10μmol/L的FA处理24 h,FA组经10μmol/L FA处理24 h,Ctrl组不作处理。采用Western blot检测p-JNK、JNK、p-p38 MAPK、p38 MAPK和MyHC蛋白水平。结果:(1)与0μmol/L FA组相比,其余各浓度组的细胞数量明显增多,细胞活力显著提高(P<0.05),EdU阳性细胞率均显著增加(P<0.05)。(2)与Ctrl组相比,FA组MyoD、MyoG和MyHC的表达水平均显著提高(P<0.05),肌管融合指数显著增加(P<0.05或P<0.01)。(3)与0 h组相比,FA处理1、3和6 h后p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值均显著升高(P<0.05或P<0.01),且随着处理时间的延长,p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值呈现逐渐升高的趋势。(4)与Ctrl组相比,FA组p-JNK、p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著升高(P<0.01);与FA组相比,FA+SP600125组p-JNK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05),FA+SB203580组p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:FA可以通过激活JNK/p38 MAPK信号通路促进小鼠C2C12成肌细胞分化。

PLA2G4C通过p38/MAPK信号通路介导线粒体自噬促进DLBCL进展的实验研究

目的研究磷脂酶A2ⅣC组(phospholipase A2 groupⅣC,PLA2G4C)在弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)中的作用及其可能调节机制。方法通过免疫印迹法(Western blot)检测PLA2G4C在DLBCL组织和细胞中的表达。构建PLA2G4C过表达或敲低表达的DLBCL细胞系,后用自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)或p38抑制剂SB203580处理细胞24h。实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测PLA2G4C转染效率;Western blot检测PLA2G4C蛋白、线粒体自噬相关蛋白[微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ/Ⅰ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ/Ⅰ,MAP1 LC3Ⅱ/Ⅰ),Beclin1,p62,PTEN诱导激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)和Parkin],p38/丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)通路相关蛋白[磷酸化p38/MAPK(phosphorylated-p38/MAPK,p-p38/MAPK)]表达水平;CCK-8法、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞增殖、侵袭和凋亡能力。进一步构建异种移植瘤裸鼠模型,观察PLA2G4C对裸鼠体内肿瘤生长及线粒体自噬的影响。结果DLBCL患者淋巴瘤组织中PLA2G4C蛋白表达显著高于反应性增生淋巴结组织(3.47±0.42 vs 1.01±0.02),差异具有统计学意义(t=-37.002,P<0.001);DLBCL细胞中PLA2G4C蛋白水平显著高于人淋巴母细胞样细胞系和B细胞淋巴瘤细胞系,差异具有统计学意义(F=73.771,P<0.001)。沉默PLA2G4C显著降低DLBCL细胞活力和侵袭能力,诱导细胞凋亡(t=6.909~11.390);过表达PLA2G4C后结果与之相反(t=2.392~19.778),差异具有统计学意义(均P<0.001)。且过表达PLA2G4C显著促进线粒体自噬的发生,而CQ或SB203580处理则可显著逆转PLA2G4C过表达对DLBCL细胞生物学行为及线粒体自噬的作用。体内裸鼠实验显示,敲低PLA2G4C显著抑制移植瘤裸鼠体内肿瘤生长及线粒体自噬相关蛋白表达,差异具有统计学意义(t=13.816~25.926,均P<0.001)。结论PLA2G4C在DLBCL中表达显著上调,可能通过促进p38/MAPK信号通路介导的线粒体自噬,促进肿瘤细胞增殖和侵袭,抑制细胞凋亡,参与DLBCL的发生发展。

葛根芩连汤对2型糖尿病db/db小鼠胰腺组织PERK/ATF4/CHOP信号通路的影响

目的观察葛根芩连汤对2型糖尿病(T2DM)小鼠胰腺内质网应激的影响,探讨其治疗T2DM的作用机制。方法75只SPF级雄性db/db小鼠随机分为模型组、二甲双胍组和葛根芩连汤高、中、低剂量组,每组15只,15只db/m小鼠作为空白组,给药组分别予相应药物灌胃12周。检测小鼠体质量、空腹血糖(FBG)及糖化血红蛋白(HbA1c),HE染色观察胰腺组织病理变化,TUNEL染色检测胰岛细胞凋亡情况,Western blot检测胰腺组织葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、p-PERK、活化转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白表达,实时荧光定量PCR检测胰腺组织PERK、ATF4、CHOP mRNA表达。结果与空白组比较,模型组小鼠体质量、FBG和HbA1c含量显著增加(P<0.01);胰腺组织结构不完整,边界模糊,内有空泡,胰岛细胞凋亡明显增加(P<0.01);胰腺组织GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP蛋白表达显著升高(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP mRNA表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较,各给药组小鼠体质量、FBG和HbA1c含量显著减少(P<0.05,P<0.01);胰腺组织病理改变有所减轻,胰岛细胞凋亡不同程度减少(P<0.05,P<0.01);葛根芩连汤高、中剂量组和二甲双胍组胰腺组织GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP蛋白表达显著降低(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP mRNA表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论葛根芩连汤可能通过抑制内质网应激PERK/ATF4/CHOP信号通路,下调相关基因和蛋白表达,减少胰岛细胞凋亡,保护胰岛细胞功能,延缓T2DM进展。

FABP4沉默通过调节PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路对妊娠糖尿病大鼠内质网应激和胰岛素抵抗的影响

目的:探讨脂肪酸结合蛋白4(FABP4)沉默通过调节蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/真核细胞启动因子2α(eIF2α)/转录因子4(ATF4)/C/EBP同源蛋白(CHOP)信号通路对妊娠糖尿病(GDM)大鼠内质网应激(ERS)和胰岛素抵抗(IR)的影响。方法:腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立GDM大鼠模型。通过尾静脉注射FABP4 siRNA质粒(si-FABP4)、阴性对照质粒(NC)和PERK激活剂(CCT020312),将大鼠随机分为Normal组、GDM组、GDM+NC组、GDM+si-FABP4组、GDM+si-FABP4+CCT020312组。检测胰腺组织中FABP4含量、血脂水平、炎症标志物水平和氧化应激标志物水平,检测胰腺组织中PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路相关蛋白表达。HTR-8/SVneo细胞分为5组:对照(Control)组、高糖(HG)组、HG+NC组、HG+si-FABP4组、HG+si-FABP4+CCT020312组,24 h后检测细胞中FABP4及PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路相关蛋白表达。结果:与Normal组相比,GDM组大鼠血清和胰腺组织中FABP4水平显著上调(P<0.05)。FABP4沉默显著降低了FBG和IR,并伴有血脂、CRP、TNF-α、IL-6及MDA水平降低和SOD、CAT水平升高(P<0.05)。此外,FABP4沉默减轻了胰腺和胎盘组织损伤。而CCT020312上调PERK、eIF2α磷酸化水平和ATF4、CHOP蛋白表达后,FABP4沉默对GDM大鼠IR、炎症、氧化应激以及胰腺和胎盘损伤的抑制作用均被逆转(P<0.05)。FABP4在HG诱导的HTR-8/SVneo细胞中上调表达,沉默FABP4可抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路蛋白表达,CCT020312则逆转这种变化(P<0.05)。结论:FABP4沉默通过抑制炎症和氧化应激,改善GDM大鼠的IR和ERS,其机制与抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路有关。

抗奥合剂通过p38 MAPK/NF-κB信号通路和ACE2/Ang1-7/Mas轴缓解急性肺损伤研究

目的探讨抗奥合剂(KAHJ)治疗小鼠急性肺损伤(ALI)的作用及机制,为其可能作为缓解新型冠状病毒(COVID-19)感染后症状的药物提供依据。方法采用网络药理学方法预测KAHJ治疗ALI的主要活性成分、潜在靶点和相关信号通路。将C57BL/6J小鼠随机分为对照组、LPS组和LPS+KAHJ组。LPS+KAHJ组小鼠灌胃KAHJ(4.76 g·kg^(-1)·d^(-1),8.8 mL·kg^(-1)·d^(-1)),其余组小鼠灌胃生理盐水(8.8 mL·kg^(-1)·d^(-1))。14 d后,腹腔注射LPS(5 mg·kg^(-1))诱导ALI模型。收集小鼠血清和肺组织,通过组织病理学观察肺组织的病理变化。采用Western blot、qPCR、ELISA和IHC等方法评估KAHJ对ALI的改善作用。结果通过网络药理学筛选出疾病和药物共同的70个核心靶基因,并显示与多个信号通路密切相关,如MAPK、NF-κB、Apoptosis、COVID-19和肾素-血管紧张素系统(Ras)信号通路等。此外,通过实验验证发现KAHJ能改善小鼠ALI后的炎症和细胞凋亡,减少肺损伤和肺水肿,抑制肺纤维化。同时,KAHJ的作用机制与p38 MAPK和NF-κB的磷酸化以及ACE2/Ang1-7/Mas轴的调控也有着密切关系。结论KAHJ可能通过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路和调控ACE2/Ang1-7/Mas轴缓解ALI,为缓解COVID-19感染后症状提供了补充和替代药物。

炎症微环境作用下P38 MAPK调控Wnt/Ca^(2+)信号通路对牙周膜干细胞成骨分化的影响研究

目的探讨炎症微环境作用下P38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cell,PDLSC)成骨分化和Wnt/Ca^(2+)信号通路的影响。方法将人PDLSC分为对照组、TNF-α组、TNF-α+SB203580组(20μmol/L SB20358)、TNF-α+SB203580+XAV939组(20μmol/L SB20358+10μmol/L XAV939),除对照组外其余各组细胞给予10 ng/mL TNF-α模拟炎症微环境。茜素红染色检测成骨分化能力,比较各组细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,RT-qPCR检测成骨关键基因Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、Osterix(OSX)蛋白、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)mRNA水平,蛋白质印迹检测P38 MAPK、β-catenin、钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、Nemo样激酶(Nemo-like kinase,NLK)蛋白质表达。结果TNF-α组细胞的染色强度明显减弱且钙化结节的数量明显减少,TNF-α+SB203580组的染色强度、钙化结节数量较TNF-α组得到明显改善,TNF-α+SB203580+XAV939组细胞的染色强度、钙化结节数量与TNF-α+SB203580组差别不明显。与对照组比较,TNF-α组ALP活性和Runx2、OCN、OSX、OPN mRNA水平降低(P<0.05),P38 MAPK蛋白质表达(P<0.05),β-catenin、CaMKⅡ、NLK蛋白质表达降低(P<0.05)。与TNF-α组比较,TNF-α+SB203580组ALP活性和Runx2、OCN、OSX、OPN mRNA水平升高(P<0.05),P38 MAPK蛋白表达质降低(P<0.05),β-catenin、CaMKⅡ、NLK蛋白质表达升高(P<0.05)。与TNF-α+SB203580组,TNF-α+SB203580+XAV939组β-catenin蛋白质表达降低(P<0.05),但ALP活性、Runx2、OCN、OSX、OPN mRNA水平和P38 MAPK、CaMKⅡ、NLK蛋白质表达比较无统计差异(P>0.05)。结论炎症微环境下条件下P38 MAPK抑制剂可提高PDLSC成骨分化能力,可能与激活Wnt/Ca^(2+)信号通路有关。

ERK1/2信号通路基因3'UTR多态性与非小细胞肺癌的相关性

目的探究4个ERK1/2信号通路的基因3'UTR区域的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点(MAPK1基因中的rs9340,NRAS基因中的rs14804,KRAS基因中的rs712和rs7973450)与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的相关性。方法纳入了478名NSCLC患者及480名健康对照者,利用TaqMan探针法对其进行基因分型检测,并分析上述4个SNP与NSCLC的相关性。结果rs9340位点的等位基因在对照组与非小细胞鳞状细胞癌组(squamous cell carcinoma,SCC)中分布频率的差异具有统计学意义(P=0.009),该结果表明rs9340位点的G等位基因可能是非小细胞肺鳞癌的保护性因素(OR=0.67,95%CI:0.50~0.91)。同时,在<50岁年龄组中,rs9340位点的等位基因在对照组和NSCLC组中的分布频率差异具有统计学意义(P=5.07×10^(-4)),该结果表明rs9340等位基因G可能是NSCLC的保护性因素(OR=0.46,95%CI:0.29~0.72)。结论MAPK1基因SNP位点rs9340可能与NSCLC的发生风险相关。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路探讨化浊解毒消痈方对溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜的保护作用

目的基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路探讨化浊解毒消痈方对溃疡性结肠炎(UC)小鼠的作用。方法将48只小鼠随机分成正常组、模型组、美沙拉嗪组(阳性药,045 g/kg)和化浊解毒消痈方高、中、低剂量组(2868、1434、717 g/kg),每组8只。除正常组外,其余各组小鼠均采用25%葡聚糖硫酸钠(DSS)自由饮用7 d建立溃疡性结肠炎模型,造模后各组灌胃给予相应剂量药物。给药7 d后,分析小鼠疾病活动指数(DAI)评分,HE染色观察结肠组织病理学改变,RT-qPCR和Western blot法检测结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA和蛋白表达。结果与模型组比较,化浊解毒消痈方各剂量组和美沙拉嗪组小鼠DAI评分降低(P<005),结肠组织病理形态得到改善,结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA和蛋白表达降低(P<005),其中高剂量组作用与美沙拉嗪组相当。结论化浊解毒消痈方能抑制结肠上皮细胞的过度凋亡,对UC小鼠结肠损伤具有保护作用,其作用机制可能与抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路活化、抑制凋亡,进而修复结肠黏膜、促进溃疡愈合有关。

二甲双胍抑制p38MAPK/ATF2信号通路改善糖尿病大鼠认知功能障碍

目的探索二甲双胍对糖尿病大鼠认知功能障碍的保护作用,探讨p38 MAPK/ATF2信号通路的作用。方法30只SD大鼠随机分成空白组、模型组及二甲双胍组,每组10只。除空白组外均给予高糖高脂饲料,50 d后腹腔注射链脲佐菌素(STZ,30 mg/kg)建立2型糖尿病脑病模型。模型制备成功后,二甲双胍组大鼠腹腔注射100 mg/kg二甲双胍,连续给药6周,空白组和模型组给予等体积蒸馏水。Morris水迷宫检测各组大鼠认知能力;HE染色观察海马区形态学变化;TUNEL染色检测神经元凋亡;Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase3以及p38 MAPK、p-p38 MAPK、ATF2蛋白的表达情况。结果二甲双胍组大鼠逃避潜伏期明显缩短,目标象限停留时间延长,穿越平台次数相应增加,海马区神经细胞结构改善、神经元凋亡数量显著降低,Bax/Bcl-2比值和Cleaved-caspase3蛋白表达水平显著降低,二甲双胍还能够抑制p-p38 MAPK、ATF2蛋白的表达。结论二甲双胍改善糖尿病大鼠认知功能,与抑制p38 MAPK/ATF2信号通路有关。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路探讨健骨颗粒对UMR-106细胞内质网应激凋亡的影响

目的探讨健骨颗粒含药血清对UMR-106成骨样细胞内质网应激ERS凋亡的影响和作用机制。方法选用UMR-106成骨样细胞,采用0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05μmol/L不同浓度的GSK2606414(PERK抑制剂)对细胞进行干预,采用CCK8法筛选GSK2606414最佳干预浓度。将生长状态较好的UMR-106细胞随机分为阴性对照组(NC组)、模型组(H_(2)O_(2)组)、健骨颗粒组(H_(2)O_(2)+JG组)和阳性对照组(H_(2)O_(2)+GSK2606414组)4组。NC组和H_(2)O_(2)组采用10%生理盐水血清干预12 h,H_(2)O_(2)+JG组采用10%健骨颗粒含药血清干预12 h,H_(2)O_(2)+GSK2606414组采用0.03μmol/L的GSK2606414和10%生理盐水血清干预12 h,除NC组外,其余各组在不更换新培养基的情况下,再分别加入10μmol/L H_(2)O_(2)干预12 h。采用激光共聚焦显微镜观察细胞内NC组和H_(2)O_(2)组GRP78和Caspase-12荧光表达情况,DCFH-DA检测活性氧(ROS)含量,激光共聚焦显微镜观察细胞内钙离子实时动态变化判断ROS/ERS模型是否成立。再采用An⁃nexin V-FITC/PI检测4组细胞晚期凋亡率,qPCR和Western blot检测4组ERS相关标志指标GRP78、PERK、eIf2α、ATF4和CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量。结果与0μmol/L组比较,0.03μmol/L的GSK2606414是干预UMR-106细胞12 h后对细胞活力没有影响的最大浓度,故使用该浓度作为后续H_(2)O_(2)+GSK2606414组的实验干预条件。与NC组相比,H_(2)O_(2)组ROS含量显著增高(P<0.01),GRP78和Caspase-12的蛋白荧光表达量明显增加,细胞内钙离子流动速度加快并持续增高,表明H_(2)O_(2)诱导UMR-106细胞ROS/ERS模型的成功建立。与NC组相比,H_(2)O_(2)组凋亡率显著增高(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量均显著增高(P<0.01)。与H_(2)O_(2)组相比,H_(2)O_(2)+JG组和H_(2)O_(2)+GSK2606414组ROS含量显著降低(P<0.01),凋亡率显著降低(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平(P<0.05)和蛋白相对表达量(P<0.01)均显著降低。结论健骨颗粒可通过PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路缓解内质网过度应激,降低成骨细胞凋亡率,发挥防治绝经后骨质疏松症的作用。

通过MAPK/ERK1/2信号通路探讨固本增骨方对MC3T3-E1成骨分化的影响

目的探讨固本增骨方含药血清对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响及与MAPK/ERK1/2信号通路的关系。方法制备固本增骨方含药血清干预MC3T3-E1细胞,CCK-8法观察各组细胞增殖情况。ALP试剂盒、茜素红染色检测各组细胞成骨矿化能力。根据CCK-8检测、ALP活性检测与茜素红染色结果筛选最佳含药血清浓度及干预时间;将MC3T3-E1细胞分A、B、C、D 4组,分别加入空白血清、20%含药血清、空白血清+PD0325901、20%含药血清+PD0325901,采用RT-PCR检测各组细胞中ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA表达水平,免疫印迹法Western blot检测各组细胞中ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2蛋白表达水平。结果与空白对照组相比,10%、15%、20%、25%含药血清组均能促进MC3T3-E1细胞增殖能力,提高ALP活性,其中20%含药血清干预48 h效果最为显著(P<0.05);茜素红染色后镜下观察在浓度为20%时染色区域钙结节数量最为密集;与A组相比,B组ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA及ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2蛋白的表达水平明显增高(P<0.05);加入阻断剂PD0325901后,C组与D组上述指标的表达明显降低(P<0.05);与D组相比,C组ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA及ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2蛋白的表达水平更低(P<0.05)。结论固本增骨方含药血清能促进MC3T3-E1细胞的增殖及矿化,并上调成骨相关因子Runx2、BMP-2的表达,其作用机制可能与激活MAPK/ERK1/2通路有关。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路探讨银杏内酯B治疗代谢性脂肪性肝病的作用

目的:通过动物实验验证银杏内酯B(GB)治疗代谢性脂肪性肝病(MAFLD)的作用是否与调控PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路,抑制内质网应激,减少肝细胞凋亡及炎症反应相关。方法:72只雄性SD大鼠随机分为正常组,模型组,辛伐他汀组,GB低、中、高剂量(GB-L、GB-M、GB-H)组(n=12),高脂高糖饲料喂养12周构建MAFLD模型(正常组除外)。治疗8周后,收集血清和肝组织。生化试剂盒检测血脂和肝脂[总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)]及肝功能[天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)];酶联免疫吸附法(ELISA)法检测血清和肝脏中的炎性因子[白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]水平;HE染色、油红O染色观察肝组织病理学;Western blot法检测肝脏组织中GRP78、PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP、Bcl-2和Bax的蛋白表达。结果:肝脏组织病理学显示,与正常组相比,模型组大鼠肝脏脂肪变性显著,与模型组相比,各治疗组脂肪变性情况有明显改善;生化指标和蛋白表达显示,与正常组相比,模型组大鼠肝脏及血清TC、TG、LDL-C、IL-1、IL-6、TNF-α,血清AST、ALT及肝脏GRP78、PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP、Bax水平显著升高(P<0.05),血清、肝脏HDL-C及肝脏Bcl-2水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,各治疗组大鼠血清和肝脏TC、TG、LDL-C、IL-1、IL-6、TNF-α,血清ALT、AST及肝脏GRP78、PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP、Bax水平显著降低(P<0.05),肝脏Bcl-2水平显著升高(P<0.05),与模型组相比,GB-H组大鼠血清和肝脏HDL-C水平明显升高(P<0.05),GB-L组和GB-M组HDL-C水平呈上调趋势,但这2组相较于模型组,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:GB对MAFLD具有治疗作用,其作用机制可能与调节PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路抑制内质网应激,缓解肝细胞凋亡及炎症反应有关。

BEP2D细胞恶性转化过程中Smad7基因对MAPK信号通路的调控

背景与目的:Smad7基因是转化生长因子(transforminggrouthfactor-茁,TGF-β)信号通路的抑制分子,有研究表明TGF-β通过活化SMAD通路和ras/MEK/ERK通路来诱导某些基因的表达。本研究旨在探讨在人永生化支气管上皮细胞BEP2D经辐射诱发恶性转化过程中,作为SMAD蛋白家族的抑制分子Smad7是否参与TGF-β对MAPK信号通路的调控。方法:将人工合成的Smad7siRNA及Smad7真核表达载体与pTet-Elk,pTet-Jun反式激活载体、报告基因荧光素酶共转染BEP2D细胞,TGF-β刺激,通过报告基因荧光素酶的表达丰度来检测Smad7对MAPK信号通路的调控。结果:永生化BEP2D细胞中,TGF-β刺激之后,Elk和Jun磷酸化活性升高(PElk=0.033,PJun=0.016);Elk或Jun同Smad7真核表达载体共转染之后,Elk磷酸化活性升高,Jun磷酸化活性降低(PElk=0.017,PJun=0.028);Elk或Jun同Smad7-siRNA共转染之后,Elk磷酸化活性降低,Jun磷酸化活性升高(PElk=0.018,PJun=0.005)。恶性化BERP35T2细胞中,TGF-β刺激之后,Elk磷酸化活性增强(P=0.006),Elk同Smad7siRNA共转染之后,Elk磷酸化活性降低(P=0.000);恶性化细胞中几乎检测不到Jun的活性。结论:在BEP2D细胞发生恶性转化过程中,Smad7基因干预MAPK信号通路,使ERK和JNK磷酸化活性的平衡失调,导致促增殖作用强于生长抑制作用,从而有助于细胞向恶性方向发展。

有氧运动对2型糖尿病大鼠腓肠肌氧化应激及MAPKs信号通路的影响

目的:研究有氧运动对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗、腓肠肌氧化应激以及MAPKs信号通路的影响。方法:健康雄性Wistar大鼠30只,随机分为正常对照组(C组)、糖尿病对照组(DC组)和有氧运动组(DE组),其中C组以普通饲料喂养,DC组和DE组以高脂饲料喂养。4周后,对DC组和DE组大鼠采用单次注射链脲佐菌素(STZ)的方法建立2型糖尿病大鼠模型,继续高脂饲料喂养4周后,DE组大鼠进行无负重游泳训练6周,训练期间C组大鼠继续以普通饲料喂养,DC组和DE组大鼠继续以高脂饲料喂养。6周后,处死所有大鼠,测试空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),测试腓肠肌超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性及丙二醛(MDA)水平,RT-PCR法测试腓肠肌p38和JNK mRNA表达,Western-blot法测试腓肠肌ERK1/2和p-ERK1/2表达。结果:和C组相比,DC组大鼠FBG、FINS和HOMA-IR均显著升高,腓肠肌SOD和GPX活性显著降低而MDA水平显著升高,腓肠肌p38、JNK1、JNK2 mRNA相对表达量显著升高,p-ERK1、ERK2和p-ERK2相对表达量显著升高而ERK1相对表达量差异无统计学意义。与DC组相比,DE组大鼠FBG、FINS和HOMA-IR均显著降低,腓肠肌SOD和GPX活性显著升高而MDA水平显著降低,腓肠肌p38和JNK1 mRNA相对表达量显著升高而JNK2 mRNA相对表达量无统计学意义,腓肠肌p-ERK1、ERK2和p-ERK2相对表达量显著升高而ERK1相对表达量无统计学意义。结论:有氧运动可激活糖尿病大鼠腓肠肌MAPKs信号通路系统,增强机体抗氧化酶SOD和GPX活性,改善糖尿病大鼠氧化应激状态,降低其胰岛素抵抗水平。

心衰康抑制慢性心衰大鼠心肌自噬及MAPK/ERK1/2信号通路

目的:探究心衰康对慢性心衰大鼠心肌自噬的影响及其与MAPK/ERK1/2通路的关系。方法:将雄性Wistar大鼠随机分为假手术(sham)组、模型(model,结扎左冠状动脉前降支法复制大鼠慢性心衰模型)组、心衰康低、中和高剂量(TL、TM和TH)组及卡托普利(captopril)组,每组12只,采用彩色多普勒超声仪评估大鼠心脏功能;HE染色观察心肌组织形态学变化;TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡情况;免疫荧光法检测心肌组织中微管相关蛋白1轻链3II(LC3-Ⅱ)表达情况;Western blot法检测心肌组织p-ERK、p-p38 MAPK、LC3-Ⅱ、beclin-1和p62的蛋白水平。结果:与sham组相比,model组左心室舒张末期内径(LVEDD)和左心室收缩末期内径(LVESD)升高,舒张末期左室后壁厚度(LVPWTd)、收缩末期左室后壁厚度(LVPWTs)和左心室射血分数(LVEF)降低,心输出量(CO)、左心室舒张压(LVDP)、左心室收缩压(LVSP)和左心室压力最大上升/下降速率(+dp/dtmax/-dp/dtmax)降低(P<0.05);心肌细胞变形、坏死,心肌纤维断裂,伴有炎性细胞浸润;细胞凋亡率升高,LC3-II阳性率升高,p-ERK、p-p38 MAPK、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1的蛋白水平均升高,p62蛋白表达降低(P<0.05)。与model组相比,心衰康各组与卡托普利组的LVEDD和LVESD降低,LVPWTd、LVPWTs和LVEF升高,CO、LVSP、LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax升高(P<0.05);心肌细胞形态逐渐恢复正常,炎性细胞浸润减轻;细胞凋亡率降低,LC3-Ⅱ阳性率降低,p-ERK、p-p38 MAPK、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1的蛋白水平均降低,p62蛋白表达升高(P<0.05)。结论:心衰康能够抑制心肌自噬,发挥心肌保护作用,其机制可能与抑制MAPK/ERK1/2通路有关。

前列腺素E2诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中p38MAPK信号通路蛋白的表达

目的:探讨前列腺素E2对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响及其机制。方法:将第3代大鼠BMSCs分为3组,空白组用完全培养基培养,前列腺素E2组用含1×10-5 g/L前列腺素E2的培养液培养,前列腺素E2+抑制剂组用p38MAPK阻断剂SB203580处理30 min后用含1×10^-5 g/L前列腺素E2的培养液培养。干预14 d后,Western blot法检测细胞中p38MAPK和磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)蛋白的表达,检测细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性,qRT-PCR法检测细胞中ALP、RunX2、骨桥蛋白(OPN)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)和核心结合因子α1(Cbfα1)mRNA的表达。结果:与空白组相比,前列腺素E2组细胞中p-p38MAPK/p38MAPK比值、ALP活性,以及ALP、Runx2、OPN、BMP-2、Cbfα1 mRNA的表达水平均升高(P<0.05);与前列腺E2组比较,前列腺素E2+SB203580组细胞中上述各指标降低(P<0.05)。结论:前列腺素E2可通过激活p38MAPK信号通路诱导大鼠BMSCs成骨分化。

TPX2通过p38 MAPK信号通路诱导直肠癌HR-8348细胞凋亡

目的:研究下调非洲爪蟾驱动蛋白样蛋白2靶蛋白(TPX2)对直肠癌细胞凋亡的影响及机制。方法:用TPX2小干扰RNA(si RNA)转染直肠癌HR-8348细胞,记为TPX2 si RNA组;以不做转染的细胞作为正常对照(control)组;以转染si RNA阴性对照(si RNA-NC)的细胞作为si RNA-NC组;用p38 MAPK抑制剂处理敲减TPX2表达后的直肠癌HR-8348细胞记为TPX2 si RNA+SB203580组。RT-qPCR和Western blot测定TPX2的表达水平,MTT法测定细胞存活率,流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot测定细胞中p38 MAPK、p-p38 MAPK、cleaved caspase-3和Bcl-2的蛋白水平。结果:TPX2 si RNA转染后HR-8348细胞中TPX2的m RNA和蛋白表达水平显著下降(P <0. 05),而转染si RNA-NC对HR-8348细胞中TPX2的m RNA和蛋白水平没有影响。敲减TPX2表达后的直肠癌HR-8348细胞存活率降低,凋亡率升高,细胞中的cleaved caspase-3、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白水平明显升高,Bcl-2水平水平降低,与control组比较,差异有统计学意义(P <0. 05)。与TPX2 si RNA组相比,TPX2 si RNA+SB203580组的HR-8348细胞凋亡率、cleaved caspase-3水平和p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白水平明显降低,存活率明显升高(P <0. 05)。结论:TPX2表达下调可以通过激活p38 MAPK促进直肠癌HR-8348细胞凋亡。

TLR2-p38MAPK信号通路在小鼠肺炎衣原体肺炎中的表达及意义

目的通过建立小鼠肺炎衣原体感染的模型,探讨小鼠感染肺炎衣原体后,其信号通路Toll样受体2(TLR2)-p38蛋白激酶(p38MAPK)中TLR2 mRNA和p38MAPK mRNA的表达变化及其信号通路抑制剂对其影响以及炎症介质表达变化的意义。方法使用TLR4基因缺失小鼠(C3H/HeJ)72只,随机分为正常组、肺炎衣原体感染组、肺炎衣原体感染加特异性p38MAPK抑制剂SB203580干预组,分别按接种后1、4、7及14 d各分4组。正常组鼻内接种2SP缓冲液,感染组鼻内接种肺炎衣原体;干预组在感染肺炎衣原体后即在腹腔注射SB203580,分别在预定的时间处死,取肺脏组织应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量方法检测肺组织TLR2 mRNA和p38MAPK mRNA的表达变化,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定TNF-α的含量。结果与正常组比较,感染肺炎衣原体后小鼠肺组织TLR2 mRNA和p38MAPK mRNA表达迅速升高,以第4 d和第7 d最明显,其中TLR2mRNA在第7 d表达量明显高于正常组[(7.24±1.78)mg/L比(0.64±0.14)mg/L],p38MAPKmRNA在第4 d表达量明显高于正常组[(9.267±1.813)mg/L比(3.734±0.946)mg/L],14 d以后感染开始减轻。其相应的肺组织TNF-α含量表达也升高,并明显高于正常组,以第4 d为高峰(77.29±9.66)pg/mg。给予SB203580抑制剂后TLR2 mRNA和p38MAPK mRNA表达明显减弱,以第4 d和第7 d明显,其中TLR2 mRNA在第7 d为(0.269±0.09)mg/L,p38 MAPK mRNA在第4 d为(0.002±0.001)mg/L,其相应的肺组织TNF-α含量表达与感染组比较也明显降低,以第4 d(25.76±3.49)pg/mg明显。结论小鼠感染肺炎衣原体后,可引起TLR2-p38 MAPK信号通路的活化,引起细胞因子的释放。SB203580对TLR2-p38 MAPK信号通路有明显的抑制作用,并能抑制炎症介质的释放,表明肺炎衣原体感染与TLR2-p38MAPK的信号通路密切相关。