三叶木通促分裂原活化蛋白激酶基因mapk3的克隆及表达分析

植物MAPK信号途径在植物生长发育以及多种逆境胁迫响应和激素调控过程中发挥着至关重要的作用。本文利用RACE-PCR技术克隆三叶木通促分裂原活化蛋白激酶基因mapk3的全长c DNA序列,并对其进行生物信息学分析和时空表达分析。克隆所得的Aktmapk3基因的ORF全长序列为1 164 bp,编码387个氨基酸,其编码的蛋白具有ATP结合位点,MAPK激酶保守结构和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶激活位点,推测其可能通过被磷酸化而激活以及通过磷酸化下游蛋白而执行生理功能。实时荧光定量PCR结果显示,Aktmapk3基因在三叶木通各组织器官均有表达,在芽成熟叶片以及花中表达量比较高,在茎、幼叶和果肉中的表达量最低,暗示该基因可能参与了三叶木通芽的形成和花的发育。

人MAPK3基因克隆及其在肝细胞癌细胞中的作用

目的克隆人MAPK3基因,探讨MAPK3基因对肝细胞癌细胞的作用。方法以肝细胞总RNA为模板,利用RT-PCR体外扩增获得人MAPK3基因的蛋白编码区,并构建重组真核表达载体pEYFP-MAPK3;脂质体转染和G418药物筛选获得MAPK3稳转肝癌细胞株;蛋白免疫印迹检测稳转肝癌细胞株中外源MAPK3蛋白的表达量;实时无标记细胞分析技术检测MAPK3基因对肝癌细胞增殖的影响;划痕愈合实验和Transwell侵袭实验分别MAPK3基因对肝癌细胞迁移和侵袭的影响;蛋白免疫印迹检测ERK信号通路靶基因及上皮-间质细胞转化标志物的表达变化。结果RT-PCR克隆获得人MAPK3基因,成功构建重组真核表达载体pEYFP-MAPK3并获得MAPK3基因稳转肝癌细胞株,发现MAPK3基因可以促进人肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭,通过磷酸化活化Stat3,促进c-Myc、MMP-2和N-Cadherin表达升高和抑制E-Cadherin表达。结论成功克隆人MAPK3基因并证明MAPK3可以有效促进肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

雌二醇对绵羊输卵管上皮细胞pik3r3、Akt、mapk3基因mRNA及蛋白表达的影响

[目的]利用雌二醇对绵羊输卵管上皮细胞进行刺激,检测与分析绵羊输卵管上皮细胞pik3r3、Akt、mapk3基因mRNA及蛋白表达的变化。[方法]以5代内的绵羊输卵管上皮细胞作为研究对象,通过qPCR及Western blot检测添加10-8 mol/L的雌二醇(以等量培养基替代雌二醇作为对照组)作用0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h后输卵管上皮细胞pik3r3、Akt、mapk3基因mRNA及蛋白的表达情况。[结果]在绵羊输卵管上皮细胞中添加10-8 mol/L雌二醇后,随着作用时间的延长,pik3r3、Akt、mapk3基因mRNA及蛋白的表达量整体呈先升高、后降低趋势。与作用0 h相比,pik3r3基因的mRNA表达量(P<0.01)及蛋白表达量(P<0.05)在雌二醇作用1.5 h时达到最高峰,Akt、mapk3基因的mRNA表达量(P<0.01)及蛋白表达量(P<0.05)在雌二醇作用2.5 h时达到最高峰。雌二醇作用3.0 h时,pik3r3、Akt、mapk3基因的mRNA表达量相比0 h都显著(P<0.05)提高。[结论]输卵管上皮细胞中pik3r3、Akt、mapk3基因的表达受到雌二醇调控。高浓度雌激素促进pik3r3、Akt、mapk3基因的高表达,这可能与生殖道的天然防御有关,并可能通过该途径提高机体自身免疫应答能力。

人MAPK3基因原核表达载体的构建及鉴定

目的探讨人丝裂原激活蛋白激酶3(MAPK3)基因原核表达载体的构建及鉴定。方法取对数生长期正常人肝细胞系HL-7702细胞,采用TRIzol法抽提细胞总RNA,以此为模板用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)反转录扩增MAPK3基因的蛋白编码区,脱氧核糖核苷酸(DNA)测序鉴定后插入原核表达载体pGEX-4t-1中构建重组原核表达质粒(命名为pGEX-MAPK3_(GST));将pGEX-MAPK3_(GST)导入细菌Rosetta(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达MAPK3融合蛋白(GST-MAPK3),采用Sepharose 4B亲和层析法纯化MAPK3融合蛋白(GST-MAPK3),采用考马斯亮蓝染色和蛋白免疫印迹分析GST-MAPK3的蛋白纯度和验证目的蛋白。结果RT-PCR法成功克隆了人MAPK3基因的蛋白编码区,DNA测序结果显示该片段无任何突变;用克隆获得的基因片段成功构建了pGEX-MAPK3_(GST),通过原核表达的方式获得了GST-MAPK3,并通过亲和层析纯化了GST-MAPK3。结论成功克隆人MAPK3基因并获得MAPK3蛋白,可用于体外研究MAPK3对细胞角蛋白18(CK18)的磷酸化作用。

KRAS基因沉默介导MAPK1/MAPK3信号通路对乳头状甲状腺癌上皮间质转化的分子机制研究

目的研究Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)基因沉默介导MAPK1/MAPK3信号通路对乳头状甲状腺癌细胞上皮间质转化的调控机制。方法收集80例乳头状甲状腺癌组织及相应癌旁组织,免疫组化法分析KRAS蛋白阳性表达率;购买人乳头状甲状腺癌细胞株TPC-1,分为空白组、阴性对照组、siRNA-KRAS组、SCH772984组、茴香霉素(Anisomycin)组、siRNA-KRAS+Anisomycin组,采用qRT-PCR和Western blotting法检测癌组织、癌旁组织和各组细胞中KRAS、C-jun氨基末端激酶(JNK)、细胞外信号调节蛋白激酶1(ERK1)、细胞外信号调节蛋白激酶2(ERK2)、p-JNK、p-ERK1、p-ERK2、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形纤维蛋白(Vimentin)及E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)的mRNA和蛋白表达水平。采用光学显微镜观察各组细胞上皮间质转化状态。结果癌组织的KRAS阳性表达率高于癌旁组织(63.75%vs.36.25%);与癌旁组织比较,癌组织中E-cadherin表达下调,KRAS、JNK、p-JNK、ERK1、p-ERK1、ERK2、p-ERK2、Vimentin和ZEB1表达上调(均P<0.05)。在细胞实验中,沉默KRAS和抑制MAPK1/MAPK3信号通路能够抑制JNK、p-JNK、ERK1、p-ERK1、ERK2、p-ERK2、Vimentin和ZEB1的表达,激活E-cadherin的表达(均P<0.05),同时抑制上皮间质转化。激活MAPK1/MAPK3信号通路能够激活JNK、p-JNK、ERK1、p-ERK1、ERK2、p-ERK2、Vimentin和ZEB1的表达,抑制E-cadherin的表达(均P<0.05),同时激活上皮间质转化。而沉默KRAS表达并Anisomycin处理,可逆转沉默造成的上述功能改变,与空白组和阴性对照组无明显差异。结论KRAS基因在乳头状甲状腺癌中高表达,沉默KRAS基因能抑制MAPK1/MAPK3信号通路,从而抑制乳头状甲状腺癌的上皮间质转化。