稳定表达PRRSV M蛋白的MARC-145^(ORF6)细胞系的构建及其对PRRSV增殖的影响

为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料,本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSVORF6基因的重组慢病毒质粒,将该质粒连同辅助质粒共同转染至HEK293T细胞获得重组慢病毒;之后将重组慢病毒感染MARC-145细胞,利用嘌呤霉素结合有限稀释法进行筛选,连续筛选3轮后建立了稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系;并使用CCK-8试验评估过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞生长的影响。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光(IFA)评估MARC-145ORF6细胞系的传代稳定性并鉴定M蛋白的亚细胞定位,进一步利用RT-qPCR评估过表达M蛋白对MARC-145细胞的干扰素及相关调节基因的影响;此外,还测定了PRRSV在MARC-145ORF6细胞系、MARC-145Flag细胞系和MARC-145细胞中的病毒滴度并绘制多步生长曲线以比较其差异。CCK-8试验结果表明,过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞活力无显著影响;RT-qPCR、Westernblot和IFA等试验结果表明,MARC-145ORF6细胞系能够表达PRRSV的M蛋白且在传代过程中稳定。此外,稳定表达PRRSVM蛋白显著下调了细胞系的Ⅰ型干扰素及其相关调节基因;多步生长曲线表明,MARC-145ORF6细胞系促进PRRSV增殖,提高其病毒滴度。综上,本研究构建了可以稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系,发现其Ⅰ型干扰素水平显著下调且促进PRRSV复制。本研究构建的MARC-145ORF6细胞系将为M蛋白功能的深入研究提供重要生物材料。

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞的长链非编码RNA和mRNA转录组分析

为了挖掘猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染Marc-145细胞后宿主细胞长链非编码RNA(lncRNA)和mRNA表达谱的变化,对PRRSV感染Marc-145细胞的lncRNA和mRNA进行转录组测序和分析。生物信息学分析结果显示,PRRSV感染后Marc-145细胞有39个差异表达lncRNA(DElncRNA)和1320个差异表达mRNA(DEG)。进一步的富集分析结果显示,这些DElncRNA和DEG主要富集在氧化磷酸化信号通路。DElncRNA和DEG的联合分析结果显示,与lncRNA共表达的mRNA主要富集在MAPK信号通路、胰岛素信号通路、神经营养素信号通路、AMPK信号通路、HIF-1信号通路、内质网中的蛋白质加工和碳代谢相关的信号通路,这些通路主要与宿主免疫有关。综上,PRRSV感染导致Marc-145细胞的lncRNA和mRNA表达谱均发生了改变,经生物信息学分析,推测差异表达产物可能在宿主对PRRSV感染的先天免疫反应中发挥重要作用。

Marc-145细胞微载体悬浮培养及PRRSV增殖工艺的建立

采用分批式培养方法研究了Marc-145细胞微载体悬浮培养及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖工艺。结果表明,在3 g/L的微载体用量下,采用1 ml 3×105个细胞的初始接种密度及培养至第3 d进行换液操作工艺可以获得最佳的Marc-145细胞生长效能。采用感染复数为0.05的接毒比例及接毒后48 h收获毒液可获得最高的PRRSV增殖效价。在5 L反应器中重复验证上述工艺,获得较为稳定的试验结果,最大细胞密度均可高于1 ml 2×106个细胞,PRRSV的增殖效价均高于108.0TCID50/ml。为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。

猪生殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞的病毒形态发生和细胞超微结构观察

以猪生殖与呼吸综合征病毒四川分离株PRRSV-SC1株感染体外培养的Marc-145细胞为模型,通过透射电镜对PRRSV的病毒形态发生学和宿主细胞超微结构的动态变化规律进行研究。结果显示,病毒粒子呈球形,有囊膜,大小约45-65nm,内含直径约25-30nm的核衣壳。病毒感染细胞后以细胞内吞方式进入细胞,在胞浆内复制,装配好的病毒以出芽或细胞外分泌释放到细胞外。感染细胞超微结构变化主要表现为:细胞胞浆空泡增多,内质网扩张,线粒体增生、嵴肿胀、脱落,最后空泡化,细胞表面的微绒毛脱落,出现典型的细胞凋亡特征,并观察到凋亡小体,最后整个细胞裂解、破碎。

Marc-145细胞培养条件摸索及其初步应用

Marc-145细胞,上皮样细胞,来源于猴肾细胞,从母细胞(Ma-104细胞)克隆而得到,可连续传代培养。此细胞主要用于病毒的培养,特别是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对此细胞尤为敏感,本试验主要研究Marc-145的适宜培养条件,以及PRRSV野毒株在该细胞中的增殖。

Marc-145细胞CD163基因克隆及其真核表达质粒构建

猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业重要传染病之一,CD163是猪繁殖与呼吸综合征感染易感细胞受体之一。从Marc-145细胞克隆出CD163基因并测序,再根据得到序列,应用Primer5.0软件设计引物,成功地扩增出带酶切位点CD163 ORF基因,通过HindⅢ和XhoⅠ双酶切位点将CD163基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1-myc-His中,获得重组质粒pcDNA3.1-CD163,并将重组质粒pcDNA3.1-CD163在BHK细胞上进行表达鉴定。结果表明,Marc-145细胞CD163蛋白在BHK细胞中得到了表达。这为进一步研究CD163受体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中作用以及与其他受体之间相互作用提供试验数据。

猪细小病毒感染Marc-145细胞后对其分泌白细胞介素6转录时相的影响

为了更好地了解猪细小病毒(PPV)感染Marc-145后引起的细胞炎性反应,特别是白细胞介素6(IL-6)的反应,以及探讨宿主与病毒之间的作用关系,运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染Marc-145细胞后病毒DNA含量的变化和IL-6的分泌水平。结果表明,病毒感染后1 h就可以检测到病毒DNA,但病毒量相对较低,在感染48 h达到最高峰,为感染时的170倍左右。IL-6的表达量在感染后1 h、3 h、24 h显著增加,48 h下降至低于对照水平,说明猪细小病毒感染后可引起Marc-145细胞分泌IL-6的增加。

Marc-145细胞无血清培养驯化、代谢分析及PRRSV增殖能力比较

采用逐步降低培养液中血清用量的方法对Marc-145细胞进行无血清培养驯化并考察其生长代谢、增殖PRRSV(猪繁殖及呼吸综合征病毒)的能力。结果表明,通过在细胞对数生长期更换低浓度血清的培养液或传代操作,Marc-145细胞可完全适应含5%新生牛血清的营养条件,经3次传代后,Marc-145细胞可营正常贴壁生长。然而在1%新生牛血清的营养条件下,初次培养于该条件的Marc-145细胞伪足不伸展,贴壁时间明显延长。经过在该1%血清浓度下10次传代后,Marc-145细胞可贴壁生长,维持较高的存活率,但贴壁较松。由此Marc-145细胞进一步驯化适应无血清悬浮培养条件,筛选获得能够在无血清条件下悬浮生长的Marc-145细胞,且生长状态良好。比较在不同血清浓度及不同培养方式下生长的Marc-145细胞增殖PRRSV的能力,无血清条件下悬浮生长的Marc-145细胞对PRRSV的增殖性能没有改变。

Nsp9基因在Marc-145细胞上对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

试验旨在验证Nsp9基因是否影响猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的复制。构建含有Nsp9全长基因的质粒pIRES2-EGFP-Nsp9,并转染到Marc-145细胞中,接毒之后分别通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法测定PRRSV N蛋白在mRNA和蛋白水平的表达。结果显示,转染Nsp9基因的Marc-145细胞上PRRSV的N蛋白在mRNA水平上显著高于未转染Nsp9基因的对照组(P<0.05),是对照组的1.5倍,同时转染Nsp9基因后的Marc-145上PRRSV N蛋白水平也明显高于对照组。随着剂量的增加,N蛋白的表达量在mRNA和蛋白水平都有所增加。由以上结果初步可知,Nsp9基因可以在Marc-145细胞上促进PRRSV的复制,Nsp9基因与其复制密切相关。

利用荧光定量PCR方法研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞中的增殖规律

为了了解猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞系上的增殖规律,利用实时荧光定量PCR技术,研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞中的增殖情况。结果发现：病毒在接种后12h开始大量增殖,且在12-36h增殖最为迅速;还发现在18h时Marc-145细胞开始释放病毒,48h达最高峰。该结果为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病机理及利用细胞毒生产疫苗提供了试验基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的MARC-145细胞中外泌体的分离与鉴定

旨在寻找有效方法,能够从PRRSV感染的MARC-145细胞中分离细胞产生的外泌体,并为探索外泌体在PRRSV感染细胞时的作用奠定基础。使用试剂盒提取MARC-145细胞产生的外泌体,利用电镜负染色法和Western blot技术对MARC-145细胞产生的外泌体进行鉴定;采用碘克沙醇速率区带离心分离MARC-145细胞产生的外泌体,并用Western blot技术检测外分泌体的分布区间。用PRRSV感染MARC-145细胞后,使用试剂盒对MARC-145细胞产生的外泌体进行初步分离后,采用免疫磁珠捕获技术进行进一步纯化,并使用Western blot进行验证。Western blot结果显示MARC-145细胞产生的外泌体存在特异性标记蛋白CD63、Tsg101和Alix,不存在外泌体非标记蛋白EEA1、GRP94和Cytochrome C;电镜负染色结果显示MARC-145细胞产生的外泌体尺寸大小处于30~100nm,符合外泌体特征。利用Western blot对碘克沙醇速率区带离心中收集到的样品进行分析,结果显示MARC-145细胞产生的外泌体分布于7.2%~18%碘克沙醇密度区间。Western blot结果显示免疫磁珠捕获法获得的对照组不存在外泌体标记蛋白Tsg-101。以上结果表明MARC-145细胞能够产生外泌体,并且通过免疫磁珠捕获法能够从PRRSV感染的MARC-145细胞中将其分离。

兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒血清在Marc-145细胞上对病毒复制影响

制备兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清,探索其对病毒复制影响,通过大量培养猪繁殖与呼吸综合征病毒XH-GD株病毒,高速离心后蔗糖梯度纯化浓缩并免疫新西兰大白兔,4免后采集抗血清,ELISA法测定效价。同时将抗血清与病毒共同孵育接种Marc-145细胞,荧光定量PCR和TCID50测定病毒复制情况。成功制备兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清,效价达1640,抗血清可以在m RNA水平和TCID50上降低病毒滴度。结果表明,兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清可以在Marc-145细胞上抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制。

猪细小病毒感染Marc-145细胞后对其分泌白细胞介素18转录时相的影响

为了解猪细小病毒(PPV)感染Marc-145细胞后引起细胞炎性反应特别是白细胞介素18(IL-18)的反应,探讨宿主-病毒之间的作用关系,运用荧光定量PCR技术,测定和分析了PPV感染Marc-145细胞后引起的病毒DNA含量的变化和IL-18的分泌水平.结果表明,IL-18的表达量在1 h无明显变化、在3,24 h增加,48 h轻微下调.表明猪细小病毒感染可引起Marc-145细胞分泌IL-18增加.

稳定表达猪SAMHD1蛋白的MARC-145细胞系构建与鉴定

SAMHD1作为宿主的天然免疫限制性因子,参与机体的天然免疫调控,在机体抗病毒感染过程中发挥重要的作用。为了建立稳定表达猪SAMHD1的细胞系,本研究将猪SAMHD1全长编码基因克隆至慢病毒载体pWPXL,构建重组质粒pWPXLpSAMHD1。将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染MARC-145细胞,经嘌呤霉素筛选后,获得表达猪SAMHD1基因的MARC-pSAMHD1细胞系。经检测发现,该细胞系传至10代,仍能稳定表达猪SAMHD1蛋白。该细胞系的建立为猪SAMHD1抗病毒特性和猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理等研究奠定了坚实的基础。

Marc-145细胞无血清培养液组分的优化筛选

目的:对Marc-145细胞无血清培养液组分及浓度进行优化筛选。方法:采用Plackett-Burman设计和中心组合旋转设计对不同的营养成分进行优化筛选。结果:经Plackett-Burman设计,利用20组实验对14种不同营养成分进行考察,发现孕酮、抗氧化试剂、乙醇胺、维生素B6、维生素B12和脂肪酸复合剂对Marc-145细胞无血清悬浮生长的比生长速率有显著影响;针对该6种因素进行中心组合旋转实验设计,利用53组实验筛选出它们的最优使用浓度分别为孕酮5.5 mg/L、抗氧化试剂250μL/L、乙醇胺2.1 mL/L、维生素B122.86 mg/L、维生素B644μg/L和脂肪酸复合剂215μL/L。结论:经2种实验设计方法优化,确定了Marc-145细胞无血清培养液组分及最适浓度,为无血清悬浮培养Marc-145细胞及增殖猪繁殖及呼吸综合征病毒提供了实验基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒SDZP株与其Marc-145细胞传代株的基因变异分析

为了研究PRRSV病毒在Marc-145细胞中长期传代后的基因变异特点,将高致病性PRRSV野毒株SDZP株感染Marc-145细胞,经连续传代120代获得了较为稳定的SDZP-p120传代毒株。通过RT-PCR分段扩增出SDZP亲本株与SDZP-p120株的全长基因,测序分析病毒传代过程中各基因的特征性变化。在传代过程中,病毒增殖速度出现了从慢到快的过程。连续传代后,SDZP-p120株出现了76个碱基的突变,涵盖了绝大部分功能基因,其中出现42个非同义突变,25个位于非结构蛋白,17个位于结构蛋白。囊膜相关结构蛋白的氨基酸突变率明显高于非结构蛋白,且多个囊膜相关结构蛋白的氨基酸突变规律与HuN4、JXA1等其他在Marc-145细胞上传代致弱的毒株具有相似性。研究结果为深入了解病毒与宿主细胞间的相互作用提供了参考数据。

Marc-145细胞传代培养条件优化

采用单因素法研究在细胞传代培养过程中复苏温度、血清浓度、生长液pH值、培养温度、消化液浓度、传代比例等因素对Marc-145细胞传代培养的影响。结果表明:复苏温度37℃、血清浓度10%、生长液pH值7.2、培养温度37℃、消化液浓度0.25%、传代比例1∶3时Marc-145细胞传代培养效果最佳。

Marc-145细胞CD151蛋白主要抗原表位区的表达及其与猪繁殖与呼吸综合征病毒感染关系的研究

为研究CD151与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的关系,根据GenBank中已发表的CD151蛋白的基因序列设计并合成一对特异性引物,从Marc-145细胞中扩增出294bp的CD151基因片段并克隆入pGEX4T-3载体,转化入大肠杆菌用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。表达蛋白纯化后用于免疫小鼠制备抗CD151蛋白血清,用ELISA和IFA检测抗血清的效价及特异性。将抗CD151蛋白血清与Marc-145细胞孵育后再感染PRRSV,观察细胞CPE验证该血清对PRRSV的阻断效果。结果表明成功构建了pGEX4T-3-CD151,获得了相对分子质量为37ku的重组CD151蛋白。制备的抗血清特异性结合Marc-145细胞并有效阻断PRRSV感染Marc-145细胞。这些研究结果为进一步阐明CD151与PRRSV感染的关系提供一定的理论基础。

PPV感染Marc-145细胞后对其分泌IL-13转录时相的影响

运用荧光定量PCR技术,测定和分析猪细小病毒(PPV)感染Marc-145细胞后引起的病毒DNA含量的变化和IL-13的分泌水平。结果IL-13的表达量在1,3和24 h明显增加,48 h轻微下调。

感染强、弱PRRSV毒株的Marc-145细胞差异基因文库的构建

【目的】用强、弱PRRSV GD株传代毒株感染Marc-145细胞,构建Marc-145细胞的差异基因cDNA文库。【方法】以感染PRRSV GD株第100代弱毒株的Marc-145 cDNA为测试组(Tester),以感染PRRSV GD株第5代强毒株的Marc-145 cDNA为对照组(Driver),采用抑制性消减杂交方法,构建强、弱PRRSV GD株感染的Marc-145细胞差异基因cDNA文库,并使用LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)技术对试验结果进行验证。【结果】经4次抑制性消减杂交重复试验,得到S8、S29、L6、L26及L30等5个稳定差异表达的基因。LAMP结果显示,S8、S29、L6、L26及L30均为差异表达基因,这与抑制性消减杂交结果吻合。【结论】成功构建了感染强、弱PRRSV毒株的Marc-145细胞差异基因文库,为研究S8、S29、L6、L26和L30基因与PRRSV感染体外培养细胞Marc-145的关系奠定了基础。