稳定表达PRRSV M蛋白的MARC-145^(ORF6)细胞系的构建及其对PRRSV增殖的影响

为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料,本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSVORF6基因的重组慢病毒质粒,将该质粒连同辅助质粒共同转染至HEK293T细胞获得重组慢病毒;之后将重组慢病毒感染MARC-145细胞,利用嘌呤霉素结合有限稀释法进行筛选,连续筛选3轮后建立了稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系;并使用CCK-8试验评估过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞生长的影响。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光(IFA)评估MARC-145ORF6细胞系的传代稳定性并鉴定M蛋白的亚细胞定位,进一步利用RT-qPCR评估过表达M蛋白对MARC-145细胞的干扰素及相关调节基因的影响;此外,还测定了PRRSV在MARC-145ORF6细胞系、MARC-145Flag细胞系和MARC-145细胞中的病毒滴度并绘制多步生长曲线以比较其差异。CCK-8试验结果表明,过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞活力无显著影响;RT-qPCR、Westernblot和IFA等试验结果表明,MARC-145ORF6细胞系能够表达PRRSV的M蛋白且在传代过程中稳定。此外,稳定表达PRRSVM蛋白显著下调了细胞系的Ⅰ型干扰素及其相关调节基因;多步生长曲线表明,MARC-145ORF6细胞系促进PRRSV增殖,提高其病毒滴度。综上,本研究构建了可以稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系,发现其Ⅰ型干扰素水平显著下调且促进PRRSV复制。本研究构建的MARC-145ORF6细胞系将为M蛋白功能的深入研究提供重要生物材料。

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞的长链非编码RNA和mRNA转录组分析

为了挖掘猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染Marc-145细胞后宿主细胞长链非编码RNA(lncRNA)和mRNA表达谱的变化,对PRRSV感染Marc-145细胞的lncRNA和mRNA进行转录组测序和分析。生物信息学分析结果显示,PRRSV感染后Marc-145细胞有39个差异表达lncRNA(DElncRNA)和1320个差异表达mRNA(DEG)。进一步的富集分析结果显示,这些DElncRNA和DEG主要富集在氧化磷酸化信号通路。DElncRNA和DEG的联合分析结果显示,与lncRNA共表达的mRNA主要富集在MAPK信号通路、胰岛素信号通路、神经营养素信号通路、AMPK信号通路、HIF-1信号通路、内质网中的蛋白质加工和碳代谢相关的信号通路,这些通路主要与宿主免疫有关。综上,PRRSV感染导致Marc-145细胞的lncRNA和mRNA表达谱均发生了改变,经生物信息学分析,推测差异表达产物可能在宿主对PRRSV感染的先天免疫反应中发挥重要作用。

lncR FOXD2-AS1调控miR-145-5p对非小细胞肺癌细胞生物学特性的影响

目的 探讨长链非编码RNA(lncR)FOXD2-AS1调控微小RNA(miR)-145-5p对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化(EMT)等生物学特性的影响。方法 体外培养人NSCLC细胞系A549、H1299、SK-MES-1及人正常肺支气管上皮细胞系16HBE,应用RT-qPCR检测各细胞系中lncR-FOXD2-AS1和miR-145-5p表达。选取lncR-FOXD2-AS1相对高表达的SK-MES-1作为敲低实验的研究对象,将SK-MES-1细胞按照转染处理的不同分为NC组(转染si-NC)和si-FOXD2-AS1组(转染si-FOXD2-AS1),转染后,RT-qPCR检测细胞中lncR-FOXD2-AS1、miR-145-5p表达,CCK-8法检测细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力,Western blotting法检测细胞中E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验验证lncR-FOXD2-AS1和miR-145-5p的相互关系。结果 与16HBE细胞相比,lncR-FOXD2-AS1在NSCLC细胞系中高表达(P<0.05),miR-145-5p在NSCLC细胞系中低表达(P均<0.05)。与NC组比较,si-FOXD2-AS1组细胞miR-145-5p表达升高(P<0.05),0、24、48 h时OD值降低(P均<0.05),迁移及侵袭穿膜细胞数减少(P均<0.05),E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05),N-cadherin、Fibronectin蛋白表达降低(P均<0.05)。双荧光素酶实验证实miR-145-5p是lncR-FOXD2-AS1的靶基因。结论 lncR-FOXD2-AS1在NSCLC细胞系中表达升高,敲低lncR-FOXD2-AS1通过靶向调控miR-145-5p抑制NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT进程。

circ-0030042通过miR-145/PTEN轴调控对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及迁移的影响

目的:探讨circ-0030042与人第10号染色体缺失的磷酸酶(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)的相互作用关系,并分析其在增生性瘢痕(Hypertrophic scar,HS)患者中对成纤维细胞增殖与迁移的影响及作用机制。方法:通过circRNA序列和定量聚合酶链反应(PCR技术)检测正常皮肤成纤维细胞(NSFBs)和增生性瘢痕患者成纤维细胞(HSFBs)中circ-0030042的表达。用CCK8检测法检测转染48 h后的HSFBs细胞增殖情况。利用stubRFP-sensGFP-LC3基因转染、流式细胞仪及电子显微镜观察circ-0030042对miR-145/PTEN轴调控VEGF水平的表达。利用生物信息学分析、RNA免疫沉淀、免疫荧光检测等方法,揭示circ-0030042介导HS患者成纤维细胞增殖与迁移的作用机制。结果:circ-0030042在增生性瘢痕中显著上调,过表达时作为VEGF海绵抑制miR-145诱导的成纤维细胞,维持体内稳定性。此外,circ-0030042通过海绵化VEGF水平并阻断其miR-145捕获转录因子(FOXO1)mRNA来影响自噬,而circ-0030042诱导FOXO1的抑制被VEGF水平过表达或circ-0030042结合减少所抵消。过表达circ-0030042对成纤维细胞的增殖抑制与VEGF表达的抑制作用被过表达miR-145部分抵消。结论:干扰circ-0030042通过靶向下调miR-145/PTEN轴进而抑制HSFBs细胞的增殖与迁移,进一步诱导恶性细胞凋亡。

血清miR-145和miR-195在OSCC患者中的表达及其与颈部淋巴结转移的关系分析

目的 分析血清微小RNA(miR)-145和miR-195在口腔鳞状细胞癌(OSCC)患者中的表达及其与颈部淋巴结转移的关系。方法 选取2020年1月至2022年6月在该院确诊的102例OSCC患者为OSCC组,收集整理OSCC患者临床病理参数,根据是否发生颈部淋巴结转移将患者分为颈部淋巴结转移组43例和无颈部淋巴结转移组59例;同期选取79例癌前病变患者为癌前病变组,86例无口腔病变的体检健康者为健康对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测血清miR-145、miR-195相对表达水平;采用受试者工作特征曲线分析检验血清miR-145、miR-195相对表达水平对OSCC患者颈部淋巴结转移的评估价值。结果 OSCC组血清miR-145、miR-195相对表达水平低于癌前病变组、健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。癌前病变组血清miR-145、miR-195相对表达水平低于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。肿瘤低分化、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期的OSCC患者血清miR-145、miR-195相对表达水平低于肿瘤中/高分化、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期的OSCC患者,差异有统计学意义(P<0.05)。颈部淋巴结转移组血清miR-145、miR-195相对表达水平低于无颈部淋巴结转移组,差异有统计学意义(P<0.05)。血清miR-145、miR-195相对表达水平单独及二者联合评估OSCC患者颈部淋巴结转移的曲线下面积分别为0.840(95%CI:0.765~0.915)、0.832(95%CI:0.754~0.910)、0.898(95%CI:0.841~0.956),特异度分别为79.1%、88.4%、77.5%,灵敏度分别为74.6%、67.8%、87.4%。结论 血清miR-145、miR-195在OSCC患者中低表达,且与OSCC患者颈部淋巴结转移、肿瘤分化程度、TNM分期有关,可作为评估OSCC患者颈部淋巴结转移的重要指标。

miR-145-5p对口腔鳞癌细胞增殖的调控作用及其机制

目的 探究miR-145-5p对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞增殖的调控作用及其机制。方法 利用GEO数据库构建OSCC的miRNA差异表达谱;通过生物信息学技术预测miR-145-5p靶基因并对其进行GO、KEGG及PPI分析;以人OSCC细胞株(HSC-3)为实验对象,将实验分为CN组(未做处理)、NC组(转染mimic NC)和miR-145-5p组(转染miR-145-5p mimic),通过CCK-8法检测不同剂量(50、100、200 nmol/L)miR-145-5p对HSC-3细胞增殖的影响;JC-1和Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测miR-145-5p对HSC-3细胞的凋亡诱导情况;RT-qPCR检测miR-145-5p调控神经母细胞瘤鼠肉瘤同系物(NRAS)、C-JUN氨基端激酶(C-JUN)、信号转导和转录激活因子1(STAT1)的表达情况。结果 miRNA差异表达谱显示,miR-145-5p在OSCC中表达下调(P<0.05);GO和KEGG分析显示,miR-145-5p靶基因主要调控MAPK信号通路;PPI蛋白互作显示,NRAS是miR-145-5p的关键靶基因之一;CCK-8结果显示,50、100、200 nmol/L的miR-145-5p转染HSC-3细胞后,细胞活力较CN组降低(P<0.05);JC-1染色结果显示,miR-145-5p组HSC-3细胞线粒体膜电位低于CN组(P<0.05);Annexin V-FITC/PI染色结果显示,miR-145-5p组HSC-3细胞凋亡率较CN组明显增加(P<0.05);RT-qPCR结果显示,与CN组比较,miR-145-5p组NRAS表达降低(P<0.05),而MAPK信号通路关键转录因子C-JUN和STAT1表达升高(P<0.05)。结论 miR-145-5p可通过靶向NRAS,并经过MAPK信号通路诱导细胞凋亡,从而抑制OSCC细胞增殖。

微小RNA-145-5p靶向Toll样受体4参与动脉粥样硬化泡沫细胞炎症和氧化应激反应

目的 探讨微小RNA-145-5p(miR-145-5p)对动脉粥样硬化细胞模型中炎性反应和氧化应激过程的调控作用。方法 体外构建人单核细胞白血病细胞源性泡沫细胞,分为模型组和对照组,采用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞内miR-145-5p相对表达。采用TargetScan数据库预测miR-145-5p与Toll样受体4(TLR4)的靶向关系。将293T细胞分为野生型+模拟物(mimic)组(转染TLR4野生型质粒+miR-145-5p模拟物)、野生型+mimic NC组(转染TLR4野生型质粒+miR-145-5p模拟物阴性对照)、突变型+mimic组(转染TLR4突变型质粒+miR-145-5p模拟物)、突变型+mimic NC组(转染TLR4突变型质粒+miR-145-5p模拟物阴性对照),采用双荧光素酶实验验证miR-145-5p与TLR4的靶向关系。体外诱导泡沫细胞,分为mimic组(转染miR-145-5p模拟物)、mimic NC组(转染模拟物阴性对照)、抑制物(inhibitor)组(转染miR-145-5p抑制物)、inhibitor NC组(转染抑制物阴性对照),采用qRT-PCR、Western blot检测TLR4 mRNA及蛋白表达,酶联免疫吸附检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)1β和IL-6表达,生化相关试剂盒测定活性氧、丙二醛和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果 与对照组比较,模型组miR-145-5p表达明显降低(0.29±0.01 vs 1.00±0.08,t=11.180,P<0.01)。双荧光素酶实验显示,miR-145-5p mimic组荧光素酶活性较mimic NC组显著降低,差异有统计学意义(t=8.612,P<0.01)。与mimic NC组比较,mimic组TLR4 mRNA及蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-6、活性氧、丙二醛含量明显降低,miR-145-5p表达、SOD活性明显升高(P<0.05,P<0.01)。与inhibitor NC组比较,inhibitor组TLR4 mRNA及蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-6、活性氧、丙二醛含量明显升高,miR-145-5p表达、SOD活性明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论 miR-145-5p通过靶向TLR4抑制动脉粥样硬化细胞模型中的炎症和氧化应激反应。

Marc-145细胞微载体悬浮培养及PRRSV增殖工艺的建立

采用分批式培养方法研究了Marc-145细胞微载体悬浮培养及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖工艺。结果表明,在3 g/L的微载体用量下,采用1 ml 3×105个细胞的初始接种密度及培养至第3 d进行换液操作工艺可以获得最佳的Marc-145细胞生长效能。采用感染复数为0.05的接毒比例及接毒后48 h收获毒液可获得最高的PRRSV增殖效价。在5 L反应器中重复验证上述工艺,获得较为稳定的试验结果,最大细胞密度均可高于1 ml 2×106个细胞,PRRSV的增殖效价均高于108.0TCID50/ml。为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。

Marc-145细胞培养条件摸索及其初步应用

Marc-145细胞,上皮样细胞,来源于猴肾细胞,从母细胞(Ma-104细胞)克隆而得到,可连续传代培养。此细胞主要用于病毒的培养,特别是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对此细胞尤为敏感,本试验主要研究Marc-145的适宜培养条件,以及PRRSV野毒株在该细胞中的增殖。

猪生殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞的病毒形态发生和细胞超微结构观察

以猪生殖与呼吸综合征病毒四川分离株PRRSV-SC1株感染体外培养的Marc-145细胞为模型,通过透射电镜对PRRSV的病毒形态发生学和宿主细胞超微结构的动态变化规律进行研究。结果显示,病毒粒子呈球形,有囊膜,大小约45-65nm,内含直径约25-30nm的核衣壳。病毒感染细胞后以细胞内吞方式进入细胞,在胞浆内复制,装配好的病毒以出芽或细胞外分泌释放到细胞外。感染细胞超微结构变化主要表现为:细胞胞浆空泡增多,内质网扩张,线粒体增生、嵴肿胀、脱落,最后空泡化,细胞表面的微绒毛脱落,出现典型的细胞凋亡特征,并观察到凋亡小体,最后整个细胞裂解、破碎。

Marc-145细胞CD163基因克隆及其真核表达质粒构建

猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业重要传染病之一,CD163是猪繁殖与呼吸综合征感染易感细胞受体之一。从Marc-145细胞克隆出CD163基因并测序,再根据得到序列,应用Primer5.0软件设计引物,成功地扩增出带酶切位点CD163 ORF基因,通过HindⅢ和XhoⅠ双酶切位点将CD163基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1-myc-His中,获得重组质粒pcDNA3.1-CD163,并将重组质粒pcDNA3.1-CD163在BHK细胞上进行表达鉴定。结果表明,Marc-145细胞CD163蛋白在BHK细胞中得到了表达。这为进一步研究CD163受体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中作用以及与其他受体之间相互作用提供试验数据。

猪细小病毒感染Marc-145细胞后对其分泌白细胞介素6转录时相的影响

为了更好地了解猪细小病毒(PPV)感染Marc-145后引起的细胞炎性反应,特别是白细胞介素6(IL-6)的反应,以及探讨宿主与病毒之间的作用关系,运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染Marc-145细胞后病毒DNA含量的变化和IL-6的分泌水平。结果表明,病毒感染后1 h就可以检测到病毒DNA,但病毒量相对较低,在感染48 h达到最高峰,为感染时的170倍左右。IL-6的表达量在感染后1 h、3 h、24 h显著增加,48 h下降至低于对照水平,说明猪细小病毒感染后可引起Marc-145细胞分泌IL-6的增加。

Nsp9基因在Marc-145细胞上对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

试验旨在验证Nsp9基因是否影响猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的复制。构建含有Nsp9全长基因的质粒pIRES2-EGFP-Nsp9,并转染到Marc-145细胞中,接毒之后分别通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法测定PRRSV N蛋白在mRNA和蛋白水平的表达。结果显示,转染Nsp9基因的Marc-145细胞上PRRSV的N蛋白在mRNA水平上显著高于未转染Nsp9基因的对照组(P<0.05),是对照组的1.5倍,同时转染Nsp9基因后的Marc-145上PRRSV N蛋白水平也明显高于对照组。随着剂量的增加,N蛋白的表达量在mRNA和蛋白水平都有所增加。由以上结果初步可知,Nsp9基因可以在Marc-145细胞上促进PRRSV的复制,Nsp9基因与其复制密切相关。

利用荧光定量PCR方法研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞中的增殖规律

为了了解猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞系上的增殖规律,利用实时荧光定量PCR技术,研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞中的增殖情况。结果发现：病毒在接种后12h开始大量增殖,且在12-36h增殖最为迅速;还发现在18h时Marc-145细胞开始释放病毒,48h达最高峰。该结果为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病机理及利用细胞毒生产疫苗提供了试验基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的MARC-145细胞中外泌体的分离与鉴定

旨在寻找有效方法,能够从PRRSV感染的MARC-145细胞中分离细胞产生的外泌体,并为探索外泌体在PRRSV感染细胞时的作用奠定基础。使用试剂盒提取MARC-145细胞产生的外泌体,利用电镜负染色法和Western blot技术对MARC-145细胞产生的外泌体进行鉴定;采用碘克沙醇速率区带离心分离MARC-145细胞产生的外泌体,并用Western blot技术检测外分泌体的分布区间。用PRRSV感染MARC-145细胞后,使用试剂盒对MARC-145细胞产生的外泌体进行初步分离后,采用免疫磁珠捕获技术进行进一步纯化,并使用Western blot进行验证。Western blot结果显示MARC-145细胞产生的外泌体存在特异性标记蛋白CD63、Tsg101和Alix,不存在外泌体非标记蛋白EEA1、GRP94和Cytochrome C;电镜负染色结果显示MARC-145细胞产生的外泌体尺寸大小处于30~100nm,符合外泌体特征。利用Western blot对碘克沙醇速率区带离心中收集到的样品进行分析,结果显示MARC-145细胞产生的外泌体分布于7.2%~18%碘克沙醇密度区间。Western blot结果显示免疫磁珠捕获法获得的对照组不存在外泌体标记蛋白Tsg-101。以上结果表明MARC-145细胞能够产生外泌体,并且通过免疫磁珠捕获法能够从PRRSV感染的MARC-145细胞中将其分离。

Marc-145细胞无血清培养驯化、代谢分析及PRRSV增殖能力比较

采用逐步降低培养液中血清用量的方法对Marc-145细胞进行无血清培养驯化并考察其生长代谢、增殖PRRSV(猪繁殖及呼吸综合征病毒)的能力。结果表明,通过在细胞对数生长期更换低浓度血清的培养液或传代操作,Marc-145细胞可完全适应含5%新生牛血清的营养条件,经3次传代后,Marc-145细胞可营正常贴壁生长。然而在1%新生牛血清的营养条件下,初次培养于该条件的Marc-145细胞伪足不伸展,贴壁时间明显延长。经过在该1%血清浓度下10次传代后,Marc-145细胞可贴壁生长,维持较高的存活率,但贴壁较松。由此Marc-145细胞进一步驯化适应无血清悬浮培养条件,筛选获得能够在无血清条件下悬浮生长的Marc-145细胞,且生长状态良好。比较在不同血清浓度及不同培养方式下生长的Marc-145细胞增殖PRRSV的能力,无血清条件下悬浮生长的Marc-145细胞对PRRSV的增殖性能没有改变。

兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒血清在Marc-145细胞上对病毒复制影响

制备兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清,探索其对病毒复制影响,通过大量培养猪繁殖与呼吸综合征病毒XH-GD株病毒,高速离心后蔗糖梯度纯化浓缩并免疫新西兰大白兔,4免后采集抗血清,ELISA法测定效价。同时将抗血清与病毒共同孵育接种Marc-145细胞,荧光定量PCR和TCID50测定病毒复制情况。成功制备兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清,效价达1640,抗血清可以在m RNA水平和TCID50上降低病毒滴度。结果表明,兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清可以在Marc-145细胞上抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制。

稳定表达猪SAMHD1蛋白的MARC-145细胞系构建与鉴定

SAMHD1作为宿主的天然免疫限制性因子,参与机体的天然免疫调控,在机体抗病毒感染过程中发挥重要的作用。为了建立稳定表达猪SAMHD1的细胞系,本研究将猪SAMHD1全长编码基因克隆至慢病毒载体pWPXL,构建重组质粒pWPXLpSAMHD1。将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染MARC-145细胞,经嘌呤霉素筛选后,获得表达猪SAMHD1基因的MARC-pSAMHD1细胞系。经检测发现,该细胞系传至10代,仍能稳定表达猪SAMHD1蛋白。该细胞系的建立为猪SAMHD1抗病毒特性和猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理等研究奠定了坚实的基础。

猪细小病毒感染Marc-145细胞后对其分泌白细胞介素18转录时相的影响

为了解猪细小病毒(PPV)感染Marc-145细胞后引起细胞炎性反应特别是白细胞介素18(IL-18)的反应,探讨宿主-病毒之间的作用关系,运用荧光定量PCR技术,测定和分析了PPV感染Marc-145细胞后引起的病毒DNA含量的变化和IL-18的分泌水平.结果表明,IL-18的表达量在1 h无明显变化、在3,24 h增加,48 h轻微下调.表明猪细小病毒感染可引起Marc-145细胞分泌IL-18增加.

Marc-145细胞无血清培养液组分的优化筛选

目的:对Marc-145细胞无血清培养液组分及浓度进行优化筛选。方法:采用Plackett-Burman设计和中心组合旋转设计对不同的营养成分进行优化筛选。结果:经Plackett-Burman设计,利用20组实验对14种不同营养成分进行考察,发现孕酮、抗氧化试剂、乙醇胺、维生素B6、维生素B12和脂肪酸复合剂对Marc-145细胞无血清悬浮生长的比生长速率有显著影响;针对该6种因素进行中心组合旋转实验设计,利用53组实验筛选出它们的最优使用浓度分别为孕酮5.5 mg/L、抗氧化试剂250μL/L、乙醇胺2.1 mL/L、维生素B122.86 mg/L、维生素B644μg/L和脂肪酸复合剂215μL/L。结论:经2种实验设计方法优化,确定了Marc-145细胞无血清培养液组分及最适浓度,为无血清悬浮培养Marc-145细胞及增殖猪繁殖及呼吸综合征病毒提供了实验基础。