不同分离方法获得的冬虫夏草无性型菌株的交配型基因MAT1-2-1的初步分析

对采用不同分离方法获得的40个冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)无性型菌株进行交配型基因MAT1-2-1的PCR特异扩增,并随机取其中7个拼接好的MAT1-2-1的碱基序列,与4个来自GenBank数据在内的共11个样品构建了系统发育树。结果表明,采自青海的7个供试菌株,连同GenBank中来自青海的菌株(FJ654176)共同组成了一大类群,而GenBank中其他地区的菌株则聚成另外的类群;随机分离得到的10个单子囊孢子菌株全部含有MAT1-2-1基因,MAT1-1:MAT1-2未见按4:4进行分离,提示冬虫夏草极有可能是同宗配型。

MAT1-siRNA体外转染抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭能力的研究

目的:观察siRNA沉默MAT1基因对胰腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响,探讨MAT1基因作为胰腺癌基因治疗标靶的可行性。方法:在脂质体介导下将MAT1基因序列特异性siRNA体外转染人胰腺癌BxPC-3细胞,采用RT-PCR和W estern印迹法分析MAT1基因的表达,锥虫蓝染色计数法和Boyden小室模型分别测定细胞的增殖和体外侵袭能力变化。结果:与对照各组相比,实验组BxPC-3细胞MAT1 mRNA和蛋白在一定时间内均表达下调,其中mRNA表达在24 h和48 h分别下调达55.2%和64.3%(P<0.01);细胞体外增殖和侵袭能力均明显受抑,差异具统计学显著性(P<0.01)。结论:针对MAT1基因的siRNA可抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭能力,MAT1可能是胰腺癌基因治疗的靶点。

沉默MAT1基因通过SDF1-CXCR4信号通路抑制骨肉瘤细胞增殖与迁移

目的探讨沉默MAT1基因表达对骨肉瘤细胞增殖与迁移的影响,以及对SDF1-CXCR4信号通路的作用。方法qRT-PCR检测人成骨细胞hFOB1.19与骨肉瘤细胞株Saos-2、MG63、U2OS、143B中MAT1 mRNA的表达水平。将对数生长期143B细胞分为空白对照组(不进行转染)、阴性对照组(转染阴性对照siRNA-NC)和siRNA-MAT1组(转染siRNA-MAT1),通过CCK-8、流式细胞术及Transwell小室法分别检测各组143B细胞增殖活力、细胞周期和迁移能力,Western blot法检测各组143B细胞中SDF1和CXCR4蛋白表达情况。结果与hFOB1.19细胞比较,骨肉瘤细胞株Saos-2、MG63、U2OS中MAT1 mRNA的表达水平明显升高(P<0.01),143B细胞中MAT1 mRNA的表达水平显著升高(P=0.000);siRNA-MAT1组143B细胞中MAT1 mRNA的表达水平较空白对照组(Blank组)和siRNA-NC组明显下降(P<0.01);与Blank组和siRNA-NC组比较,siRNA-MAT1组143B细胞增殖力明显降低,G 1期比例升高而S期比例降低,细胞迁移能力受到抑制,SDF1和CXCR4蛋白表达水平也明显下降(P<0.01)。结论沉默FOSL2基因的表达可抑制骨肉瘤细胞143B的增殖和迁移能力,机制可能与下调SDF1和CXCR4表达有关。

核盘菌交配型基因mat1-1敲除载体的构建及转化

利用根癌农杆菌介导真菌遗传转化方法对核盘菌的交配型基因mat1-1进行基因同源重组的敲除对比实验,获得了缺失mat1-1基因的转化菌株.先利用PCR方法获得mat1-1基因的左右两侧片段,将测序正确的两个侧翼片段分别重组到农杆菌转化载体PBI-G3C中,并将新霉素抗性标记引入农杆菌转化载体PBI-G3C中,构建成农杆菌介导转化核盘菌的打靶载体ΔPBI-G3CN-mat1-1,再将ΔPBI-G3CN-mat1-1质粒转化至根癌农杆菌EHA105中.利用核盘菌菌丝进行转化,将得到的转化菌株,利用PCR方法进行验证,证实有敲除菌株存在.通过对敲除菌株进行生理表型的测定发现,缺失mat1-1基因的敲除菌株其生长速度与野生核盘菌菌株相比无明显差异,但敲除菌株不能产生菌核与子囊盘.

MTA1基因的表达水平与胃癌淋巴结转移相关性的临床研究

目的:探讨胃癌组织MTA1基因的表达水平与其淋巴结转移的相关性。方法:选择50例淋巴结转移的胃癌手术病例,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术分别检测正常胃黏膜、胃癌原发灶、胃癌转移灶组织中的MTA1mRNA表达水平,对相关结果进行组间的Wilcoxon符号秩检验。结果:实验病例中胃癌转移灶、胃癌原发灶组织中的MTA1mRNA表达阳性率间有统计学差异(P<0.05);两者与正常胃黏膜相比较,均有显著统计学差异(P<0.01)。结论:MTA1基因的表达水平与胃癌淋巴结转移程度存在一定相关性,表明该基因在胃癌淋巴结转移中可能起着重要的作用,同时可用于临床辅助诊断、判断疗效、疾病预后,也可为胃癌分期和新药研发提供依据和思路,临床应用具有很大的前景。

子囊菌交配型基因MAT1-1的系统发育

子囊菌具有无性态与有性态的复杂性,以及人们对其系统发育和亲缘关系了解的局限性,进而导致菌物学家对子囊菌分类尚持不同意见。子囊菌的交配型基因(MAT)进化保守,且编码的蛋白质调控子囊菌的有性生殖过程。核盘菌Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary隶属于子囊菌门Ascomycota、盘菌纲Discomycete,是一种典型丝状同宗配合真菌,控制该菌有性生殖的交配型基因MAT1-1和MAT1-2紧密连锁,且该菌并无有性态与无性态的复杂性。故此,本文根据所克隆的核盘菌交配型基因MAT1-1,利用PAUP*软件将82种含有Alpha-box交配型基因的子囊菌进行了系统进化分析,通过核苷酸及氨基酸水平的系统发育分析,并结合Ainsworth(1973)分类系统及最新的Deep Hyphae(2006)分类系统的对比研究,发现所构建的系统进化树与传统分类所表现的进化关系基本一致,且核盘菌交配型基因MAT1-1在进化过程中功能相对保守,该分析结果有助于对其他子囊菌交配型基因的克隆、系统分类与进化研究,同时对核盘菌的亲缘关系、病害预测及防治等具有重要意义。

小干扰RNA沉默MAT1基因治疗胰腺癌的实验研究

目的了解体外转录法合成的小干扰 RNA(siRNA)沉默 MAT1基因对胰腺癌的体内体外抗癌效应。方法用 siPORT-脂质体(lipid)中性阳离子脂质体转染由体外转录法合成、Cy3荧光标记的双链 siRNA 人胰腺癌 BxPC3细胞,观察对胰腺癌细胞生长和细胞周期曲线的影响,检测 MAT1基因被 siRNA 沉默后 mRNA 和蛋白质的表达水平。在裸鼠胰腺癌皮下移植瘤瘤体内直接注射 siRNA观察抑瘤效应。结果合成的4条 MAT1-siRNA 序列中有一半可显著抑制 BxPC3细胞的生长。体外转染 MAT1-siRNA 72 h 后,BxPC3细胞生长抑制率达34.9%(P<0.01);83.9%的 BxPC3细胞滞留于G_0/G_1期,而空白对照组仅59.86%(P<0.01)。体外转染 MAT1-siRNA 48 h 后 MAT1-mRNA 水平下调了80.12%,72 h 后 MAT1蛋白质水平下调了50.12%,与各对照组相比差异均有统计学意义(均 P<0.01)。MAT1-siRNA 注射组裸鼠移植瘤重量和体积均明显低于对照组(均 P<0.05),抑瘤率达42.53%。结论 siRNA 介导的 MAT1基因沉默在体外实验中显著抑制了胰腺癌细胞的生长,在体内实验中对裸鼠胰腺癌皮下移植瘤产生明显的抑瘤效应。