冠突曲霉UBC与MAT1-2-1互作关系验证及功能研究

【目的】验证冠突曲霉泛素结合酶(UBC)与交配型蛋白(MAT1-2-1)的互作关系,对UBC基因进行功能研究,为深入解析冠突曲霉有性产孢机制提供理论参考。【方法】采用实时荧光定量PCR检测UBC基因在冠突曲霉有性发育阶段的表达水平,酵母双杂交试验验证MAT1-2-1与UBC的互作关系,利用无缝克隆方法构建pDHt/sk-hyg-UBC过表达载体,并转化冠突曲霉获得UBC过表达菌株,对过表达菌株进行表达量检测、形态学观察及氧和盐胁迫的耐受性测定。【结果】PCR克隆获得UBC基因的编码区(CDS)序列,长度为474 bp,编码157个氨基酸残基,相对分子质量为39587.24 Da,理论等电点为5.16,为疏水的不稳定蛋白,含跨膜结构域,定位于细胞核,属于UBCc超家族成员。有性发育阶段(闭囊壳形成期和子囊孢子大量形成期)UBC基因的相对表达量显著高于营养菌丝体阶段(P<0.05,下同)。自激活检测结果显示,UBC无自激活作用;酵母双杂交验证结果显示,UBC与MAT1-2-1存在互作关系。通过构建过表达载体pDHt/sk-hyg-UBC成功获得UBC过表达菌株(OE::UBC)。与野生型菌株相比,UBC和MAT1-2-1基因在UBC过表达菌株的相对表达量均显著升高。UBC过表达菌株与野生型菌株在MYA、MYA+5%NaCl和MYA+17%NaCl固体培养基上的菌落形态无明显差异。过表达菌株能分别在含18 mmol/L过氧化氢和25%NaCl的培养基中生长,而野生型菌株不能生长,说明UBC基因的过表达提高冠突曲霉对氧胁迫和盐胁迫的耐受性。【结论】UBC基因可能与冠突曲霉的有性发育相关,且与MAT1-2-1基因存在共表达特征。由于UBC与MAT1-2-1存在互作关系,且UBC基因的过表达可明显增强冠突曲霉的抗氧化和抗盐能力,故推测UBC通过与MAT1-2-1发生互作共同参与冠突曲霉的氧胁迫和盐胁迫应答过程。

不同分离方法获得的冬虫夏草无性型菌株的交配型基因MAT1-2-1的初步分析

对采用不同分离方法获得的40个冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)无性型菌株进行交配型基因MAT1-2-1的PCR特异扩增,并随机取其中7个拼接好的MAT1-2-1的碱基序列,与4个来自GenBank数据在内的共11个样品构建了系统发育树。结果表明,采自青海的7个供试菌株,连同GenBank中来自青海的菌株(FJ654176)共同组成了一大类群,而GenBank中其他地区的菌株则聚成另外的类群;随机分离得到的10个单子囊孢子菌株全部含有MAT1-2-1基因,MAT1-1:MAT1-2未见按4:4进行分离,提示冬虫夏草极有可能是同宗配型。