circ-MAT2B调节前列腺癌细胞DU145生物学行为的分子机制

目的 circ-MAT2B在前列腺癌中的表达及其可能作用机制尚不清楚。文中旨在探讨circ-MAT2B调控miR-491-5p/PEG10轴对前列腺癌细胞DU145增殖、迁移、凋亡的影响。方法 收集2019年1月至2020年1月咸宁市中心医院泌尿外科接受根治性切除手术的37份前列腺癌组织和正常邻近组织样本(癌旁组织)。根据待转染物不同将DU145细胞分为si-NC组、si-circ-MAT2B组、miR-NC组、miR-491-5p mimic组、si-circ-MAT2B+miR-491-5p inhibitor组,未转染DU145细胞记为对照组。RT-qPCR检测前列腺癌组织和对应癌旁组织中circ-MAT2B和miR-491-5p相对水平;平板克隆实验、CCK-8实验检测DU145增殖能力;划痕愈合实验和Transwell实验检测DU145迁移能力;流式细胞术检测细胞凋亡率;蛋白质印记法分析PEG10蛋白表达;双荧光素酶报告实验分析miR-491-5p与circ-MAT2B或PEG10的相互作用。结果 前列腺癌组织中circ-MAT2B相对水平(4.04±0.33)较癌旁组织(1.04±0.13)显著升高(P<0.05),miR-491-5p相对水平(0.25±0.05)较癌旁组织(1.00±0.10)显著降低(P<0.05)。与对照组、si-NC组比较,si-circ-MAT2B2组DU145细胞miR-491-5p表达、凋亡率显著升高(P<0.05),PEG10蛋白表达、细胞存活率、克隆形成数、迁移距离、侵袭数显著降低(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-491-5p mimic组DU145细胞凋亡率显著升高(P<0.05),PEG10蛋白表达、细胞存活率、克隆形成数、迁移距离、侵袭数显著降低(P<0.05)。与si-circ-MAT2B2组比较,si-circ-MAT2B+miR-491-5p inhibitor组DU145细胞凋亡率显著降低(P<0.05),PEG10蛋白表达、细胞存活率、克隆形成数、迁移距离、侵袭数显著升高(P<0.05)。miR-491-5p分别与circ-MAT2B、PEG10直接结合。结论 干扰circ-MAT2B可诱导前列腺癌细胞DU145凋亡,抑制其增殖和迁移,其抗肿瘤机制可能与上调miR-491-5p/PEG10轴有关。

慢病毒介导shRNA干扰MAT2A与MAT2B基因抑制猪肌内脂肪细胞分化

【目的】腺苷甲硫氨酸转移酶(MAT)在ATP的作用下,催化生成体内重要的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)。通过构建慢病毒介导的pLenti-H1干扰载体,探究腺苷甲硫氨酸转移酶MAT2A和MAT2B对猪肌内脂肪细胞分化的影响。【方法】无菌条件下采集3—7日龄小猪背最长肌,采用差速贴壁法分离猪肌内脂肪细胞。根据GenBank中猪MAT2A基因序列(AccessionNo.NM001167650.1)和MAT2B基因序列(AccessionNo.NM001142832.1),获得其CDS序列。利用Invitrogen公司在线软件BLOCK-iTTM RNAi Designer分别设计shRNA靶序列,将合成的单链寡核苷酸退火形成双链,与经过Bam H I和Xho I (TaKaRa)双酶切后的pLenti-Hl载体连接,转化,并提取质粒进行酶切和测序鉴定。采用X-tremeGENE-HP DNA转染试剂与测序成功的重组质粒以及包装质粒(CMV-Δ8.9和CMV-VSVG)共转染293T细胞,48 h后观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,并进行滴度测定。在猪原代脂肪细胞密度达到70%—80%时,侵染病毒;细胞密度融合时诱导分化。提取分化第8天的猪肌内脂肪细胞的RNA,按照反转录试剂盒操作说明进行反转录,合成cDNA第一链。采用primer primer 5软件设计MAT2A、MAT2B、PPARγ、aP2、CEBP/α、β-actin基因的定量引物,实时定量和Western blot试验检测MAT2A和MAT2B基因的干扰效率。油红O染色和实时定量鉴定MAT2A和MAT2B基因对猪肌内脂肪脂质积累的影响。【结果】酶切及测序证明重组慢病毒载体pLenti-Hl-MAT2A/MAT2B构建成功;包装的慢病毒sh-MAT2A和sh-MAT2B病毒滴度分别为6.7×107和7×107 pfu/mL,侵染肌内脂肪细胞72 h后,可出现90%的绿色荧光蛋白(GFP),表明所包装的病毒可满足侵染猪前体肌内脂肪细胞需要。实时定量结果显示其显著抑制了MAT2A和MAT2B的m RNA水平表达,其干扰效率分别在70%和60%以上;进一步采用Western blot试验及蛋白分析表明,干扰MAT2A基因后,MAT2A蛋白表达水平降低40%左右,差异达到极显著水平(P<0.01);干扰MAT2B基因后,MAT2B蛋白表达水平降低25%左右,差异达到显著水平(P<0.05)。油红O染色和吸光度定量结果显示,与sh-scramble对照组相比,干扰MAT2A和MAT2B基因后,脂滴聚积能力显著抑制猪肌内脂肪细胞脂质积累。实时定量结果显示,干扰MAT2A和MAT2B基因抑制成脂标志基因PPARγ,aP 2及CEBP/α的表达。【结论】成功构建了猪MAT2A和MAT2B基因的慢病毒sh-MAT2A和sh-MAT2B干扰载体。获得的重组慢病毒感染细胞后,能有效降低猪肌内前体脂肪细胞内MAT2A和MAT2B基因的m RNA和蛋白水平表达;进一步试验证明,干扰MAT2A及MAT2B基因后,显著抑制猪肌内脂肪细胞的脂质积累以及成脂关键基因表达。

MAT2B基因在肝癌组织的表达及其临床意义

目的 探讨MAT2B基因在肝癌组织的表达及其在肝癌形成和发展中的作用。 方法 收集8例的手术切除肝癌组织标本分别由反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和62例病理组织切片免疫组织化学测定肝癌组织中MAT2B的表达，10例外伤正常肝组织作为对照。对癌旁及肝癌组织MAT2B表达阳性患者进行随访。结果 MAT2B基因在正常肝组织中没有表达，肝癌组织中MAT2B的表达阳性率为80.65%，显著高于癌旁组织的62.90%。RT-PCR检测肝癌组织、癌旁组织的表达分别为1.05±0.12、0.48±0.06和0；MAT2B的表达与肝癌的大小以及是否合并有肝硬化明显相关，与患者年龄、性别、分化程度、分期无明显相关。癌旁组织MAT2B阳性者较癌旁组织MAT2B阴性者、肝癌组织MAT2B阳性者生存时间明显缩短。 结论 MAT2B基因的表达与肝癌的形成及预后有关。

中国西门塔尔牛MAT2B基因多态性及其与肉品质性状的关联分析

为了研究中国西门塔尔牛甲硫氨酸腺苷转移酶2B(Methionine adenosyltransferase 2B,MAT2B)基因的多态性及其与肉品质性状的关系,试验采用DNA测序技术和PCR-RFLP方法对127头中国西门塔尔牛MAT2B基因的多态性进行研究,并通过SPSS 23.0软件分析其与肉品质性状的相关性。结果表明:电泳得到的条带明亮、清晰,无引物二聚体、抹带和非特异性扩增条带,大小为933 bp。在中国西门塔尔牛群中,MAT2B基因存在1个位于第2内含子5'端的第2382个碱基的多态性位点,即I2-2382 G>T位点。该位点属于中度多态,且处于Hardy-Weinberg平衡状态。该位点存在GG、GT、TT 3种基因型,GG基因型个体的肾脏脂肪、屠宰酸度、胴体深、胴体胸深显著高于TT基因型(P<0.05),腰部肉厚显著低于TT基因型(P<0.05),胴体长显著高于GT基因型(P<0.05);GT基因型个体的屠宰率显著高于TT基因型(P<0.05)。说明MAT2B基因的I2-2382 G>T位点可作为中国西门塔尔牛肉品质性状的相关分子标记。