mBD1-mBD3融合基因真核表达载体构建及体外抗流感病毒初步研究

目的构建小鼠β-防御素1和β-防御素3(mBD1,mBD3)融合基因的真核表达载体,研究mBD1-mBD3融合蛋白的抗流感病毒作用。方法通过RT-PCR和重建PCR方法构建mBD1-mBD3融合基因;经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pcDNA3.1(+),构建成重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD1-mBD3,对重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定;将构建好的真核表达载体转染MDCK细胞,G418筛选稳定表达株,RT-PCR和免疫荧光染色法鉴定胞内mBD1-mBD3的表达。用流感病毒感染稳定表达细胞株,TCID50测定并分析抗流感病毒作用。结果成功克隆到mBD1-mBD3基因,并构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/mBD1-mBD3。RT-PCR和间接免疫荧光证实重组质粒可以在细胞内表达。实验组的TCID50显著高于对照组,初步显示出mBD1-mBD3的抗流感病毒作用。结论本研究成功构建了pcDNA3.1(+)/mBD1-mBD3真核表达载体,且能在MDCK细胞中稳定表达,表达产物具有一定的抗流感病毒作用。为进一步深入研究mBD1-mBD3的生物学特性及其抗流感病毒作用机制奠定了基础。

CXXC锌指蛋白1在恶性肿瘤中的研究进展

CXXC锌指蛋白1(CXXC finger protein-1,CFP1)是一种表观遗传调控因子,在哺乳动物细胞内参与DNA甲基化和组蛋白修饰。研究表明CFP1的失调影响细胞的基因表达、DNA损伤修复、信号转导、增殖、分裂、分化等,与恶性肿瘤的发生发展、治疗及不良预后密切相关。本文简要综述CFP1的基本功能及在恶性肿瘤中的研究进展,以期为后续研究新的肿瘤标志物和潜在的治疗靶点提供依据。

Tet-On系统中多西环素对MBD1诱导表达的调控研究

【目的】构建甲基结合蛋白1(MBD1)的Tet-On可诱导表达质粒和293T细胞,探讨多西环素(Dox)对MBD1表达的影响,并通过分析细胞中质粒启动子CpG甲基化水平反映MBD1调控机制。【方法】使用MBD1引物扩增293T的MBD1表达序列,将其连接于Tet-On诱导表达质粒的多克隆位点;将构建成功的质粒用电转染的方法转入MBD1 KO 293T,使用荧光显微镜及Western blot验证获得的MBD1恢复的293T(MBD1 RE 293T);使用不同浓度Dox诱导MBD1表达,利用Western blot检测单克隆细胞中MBD1的表达情况;使用同一浓度Dox诱导MBD1表达,在12、24、48、96、144、192 h收集细胞,利用Western blot检测细胞中MBD1的表达情况;使用亚硫酸氢盐测序方法检测Dox诱导后细胞内可诱导质粒启动子CpG甲基化情况。【结果】成功构建Tet-On诱导表达MBD1质粒;与未诱导细胞相比,Dox诱导后转染细胞MBD1蛋白重新表达;随着Dox浓度的升高细胞中MBD1的表达逐渐增多;相同浓度Dox诱导后,从12-96 h细胞内MBD1的表达逐渐升高,但144 h后MBD1表达下降;细胞内质粒启动子CpG甲基化检测显示,与96 h相比,144和192 h质粒启动子甲基化水平逐渐升高;在诱导144 h加入甲基转移酶抑制剂地西他滨(decitabine)后,质粒启动子甲基化水平降低,MBD1表达升高。【结论】Tet-On可诱导细胞中重新表达MBD1蛋白,并且表达量与Dox浓度正相关,但长时间诱导后细胞内质粒CpG甲基化水平升高,影响细胞中MBD1的表达。

基于表观遗传学探讨消异方对子宫内膜异位症大鼠内膜细胞的防护机制

目的:研究消异方对大鼠子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)在位及异位内膜组织中DNMT1、DNMT3a、Mbd2等表达水平的影响,基于表观遗传学探讨消异方对子宫内膜细胞的保护作用。方法:制作病证结合气滞血瘀证EMs大鼠动物模型,造模成功后随机分为模型对照组、散结镇痛胶囊组、中药高剂量组、中药低剂量组,另设空白对照组,每组24只。散结镇痛胶囊组灌胃给予散结镇痛胶囊(0. 05 g/m L),中药低剂量组(1 g/m L)、中药高剂量组(4 g/m L)给予消异方水煎剂,空白对照组及模型对照组大鼠均给予生理盐水,以上各组给药容积均为10μL/g,2次/d,连续28 d。采用RT-PCR检测EMs大鼠在位及异位内膜组织中DNMT1、DNMT3a、Mbd2等的表达水平。结果:与空白对照组正常内膜对比,模型对照组DNMT1、DNMT3a呈低表达,Mbd2呈高表达,差别均有统计学意义(P <0. 01); DNMT1、DNMT3a在模型对照组异位与在位内膜的表达对比,差别均无统计学意义(P> 0. 05)。与模型对照组对比,中药低、高剂量组和散结镇痛胶囊组的DNMT1、DNMT3a呈高表达,Mbd2呈低表达,差别有统计学意义(P <0. 01)。与中药低剂量组对比,DNMT1、DNMT3a在中药高剂量组呈高表达(P <0. 05),Mbd2呈低表达(P <0. 05)。结论:消异方可以通过提高EMs大鼠异位内膜组织中DNMT1和DNMT3a的表达、降低Mbd2的表达来治疗EMs。