MBL基因多态性与新疆汉族人群结核病易感性的研究

目的探讨MBL基因多态性与新疆汉族人群结核病高发的关系。方法采用病例-对照研究方法和引物序列特异性PCR扩增(PCR-SSP)技术对新疆地区的231例肺结核患者和226例健康志愿者的MBL基因H/L、P/Q和A/B 3个多态性位点进行基因及单倍体分型,比较各等位基因及单倍体型的频率(f),并计算优势比(OR)。结果对照组MBL基因AA基因型频率显著高于肺结核病例组(χ2=4.576,OR=0.613,P<0.05);而肺结核病例组MBL基因AB基因型频率显著高于健康对照组(χ2=4.821,OR=1.673,P<0.05)。结论 MBL基因AA基因型与新疆汉族人群结核病负相关,其可能为当地汉族人群结核病的抵抗基因;而MBL基因AB基因型与新疆汉族人群结核病相关,其可能是当地汉族人群结核病的易感基因。

甜蛋白基因MBLII对莴苣的遗传转化

以 4日龄莴苣 (LactuasativaL .)无菌苗子叶为外植体 ,通过根癌农杆菌介导 ,成功地进行了马槟榔甜蛋白基因MBLII对莴苣的遗传转化。抗生素浓度和子叶外植体与农杆菌的共培养时间是影响转化的重要因素。附加卡那霉素 (Kan) 50mg/L的诱芽培养基MSI(MS +NAA 0 .1mg/L +6 BA 0 .1mg/L +羧卞青霉素 50 0mg/L)最适于侵染后子叶外植体的诱芽培养。在外植体与农杆菌共培养 0～ 7d的范围内 ,以共培养 3d最佳 (生芽率 58.3% ,白化率 2 9% )。 1～ 2cm再生芽移入诱根培养基MSII (MS +NAA 0 .0 5mg/L +Kan 50mg/L +羧苄青霉素 30 0mg/L)中 ,诱根率可达 10 0 %。获得的抗性植株经组织化学及PCR特异扩增鉴定和统计 ,7.6%阳性。Southernblot结果证明MBLII基因已整合到莴苣基因组中。

广东地区汉族人MBL基因GGC54GAC点突变的初步筛查

目的 对广东地区汉族人群的甘露聚糖结合凝集素结构基因第一外显子第 5 4位密码点突变 (GGC5 4GAC)进行初步筛查。方法 提取外周血白细胞DNA进行相应片段的PCR扩增 ,再对产物进行单链构象多态性分析。结果 在 16 6人中查出野生型纯合子 14 7例 ,占 88.5 5 % ,GGC5 4GAC突变杂合子 19例 ,占 11.4 5 % ,未发现GGC5 4GAC突变纯合子。结论 广东地区汉族人群MBL基因GGC5 4GAC突变频率为 0 .0 5 7。

甜蛋白基因MBLII对番茄的遗传转化

以5～7d龄的 丽春 番茄无菌苗子叶作为外植体,研究了子叶外植体对抗生素卡那霉素的敏感性,抗生素卡那霉素对番茄筛选的适宜浓度为70mg/L.通过根癌农杆菌 Agrobacteriumtumefaciens 介导,成功地进行了马槟榔甜蛋白基因MBLII对番茄的遗传转化,获得转化番茄抗性植株,组织化学法有阳性表现、PCR特异扩增及Southern杂交检测出现特异条带,表明MBLII基因已顺利整合到转基因番茄植株的基因组.

广东地区汉族人MBL基因点突变的研究

目的:研究我国汉族人群甘露聚糖结合凝集素(MBL)结构基因外显子1第52、54、57位密码点突变(CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA)。方法:收集广东地区汉族普通人群的血标本,提取白细胞基因组DNA,以PCR扩增目的基因片段,应用荧光探针杂交可视技术检测其MBL基因的点突变。结果:从202份样本中,检出GGC54GAC点突变纯合子6例和杂合子44例(等位基因频率为0.139),GGA57GAA点突变杂合子1例(频率为0.002),未发现CGT52TGT点突变(频率为0)。结论:广东地区汉族人群MBL基因点突变的频率较高,为防治MBL缺损病提供了一定的实验依据。

三个牛品种MBL1基因第一内含子与第二外显子遗传多态性研究

采用巢式PCR、DNA测序和CRS-PCR方法,研究中国荷斯坦牛、鲁西黄牛、渤海黑牛的MBL1基因内含子1和外显子2的单核苷酸多态性(SNPs),发现了855(G/A)、2651(G/A)和2686(T/C)3个新SNP位点。855(G/A)位于内含子1上,2651(G/A)导致Val24 Ile氨基酸的改变,2686(T/C)为同义突变。3个SNP位点在3个牛品种群体中优势等位基因相同,分别为G、G、C,其等位基因频率分别为0.87/0.58/0.57、1/0.75/0.74、1/0.76/0.63。经χ2适合性检验,荷斯坦牛在855(G/A)位点、鲁西黄牛在855(G/A)、2651(G/A)位点、渤海黑牛的所有位点达到Hardy-W e inberg平衡状态(P>0.05)。3个牛品种在855(G/A)位点均表现为低度多态;在2651(G/A)和2686(T/C)位点均表现为中度多态(0.25<PIC<0.5)。

猪MBL-C及DUSP1基因变异对猪繁殖与呼吸综合征病毒抗性影响的初步分析

分析了MBL-C-exon6-A296G和DUSP1-exon4-C308T2个SNP对猪繁殖与呼吸综合征病毒抗性的影响。首先从猪的尾组织及血液中提取DNA,然后利用等位基因特异性聚合酶链反应(allele specific-polymerase chain reaction,AS-PCR)技术和SAS(9.1)软件在98头大约克猪和166头长大猪群体中进行上述2个SNP位点多态性与猪繁殖与呼吸综合征病毒抗性之间的相关性分析。结果显示,MBL-C基因突变位点与DUSP1基因突变位点在两个群体中都存在3种基因型,分别为AA、AG、GG和CC、CT、TT基因型。相关性分析表明,在大约克群体中MBL-C基因位点AG基因型发病风险可能只有GG基因型的0.37倍(P=0.039);在长大群体中该位点AA基因型发病风险可能只有GG基因型的0.11倍(P=0.04),并且在该群体中的初生死仔率方面(含木乃伊、死胎),这3种基因型的差异虽然没有达到显著水平,但是AA基因型的平均数初生死仔率(0.14)低于AG基因型(0.45)和GG基因型(0.44)。DUSP1基因SNP位点各个基因型在两个群体中的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗性及产死仔率均没有显著的影响。本研究认为MBL-C-exon6-A296G这个SNP位点对猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗性有影响且A等位基因可能为抗性基因。

海南黑山羊MBL2基因的转录调控元件的筛选与分析

甘露聚糖结合凝集素C(mannose binding lectin C,MBL-C)是C型(Ca^(2+)依赖型)凝集素超家族的成员,其作为一种急性期蛋白,具有抗细菌感染的功能,参与机体的天然免疫反应。为鉴定出结合在MBL2基因启动子区(1009 bp)的重要转录因子,探寻该基因的转录调控机制,本研究选取海南黑山羊MBL2基因的启动子序列1009 bp,采用DNA重组技术克隆6个转录起始位点上游1009 bp的启动子5′端侧翼缺失序列,克隆片段经双酶切后连接至pGL3-Basic载体。重组质粒转染至293T细胞中,结合双荧光素酶活性检测系统筛选MBL2基因的核心启动子区域。通过在线生物信息学软件预测山羊MBL2基因的核心启动子区域的转录因子结合位点,利用点突变技术构建转录因子结合位点缺失的载体,转染293T细胞后结合双荧光素酶活性检测系统分析其转录活性。结果表明,海南黑山羊MBL2基因的核心启动子区域位于转录起始位点上游-304~-45 bp范围内,在线软件分析该区域存在RELA、NF-κB2、MZF1等3种转录因子结合位点。双荧光素酶报告分析结果表明,RELA和NF-κB2的结合位点缺失后均使山羊MBL2基因的转录活性极显著下降(P<0.01)。结果提示,RELA和NF-κB2对山羊MBL2基因的转录活性可能具有重要的正调控作用。该研究为进一步探寻海南黑山羊MBL2基因的功能提供理论依据。

MBL基因H/L、P/Q位点多态性与新疆维吾尔族结核病的相关性研究

目的探讨MBL基因H/L、P/Q位点的多态性是否与新疆维吾尔族人群结核病发病相关。方法通过使用引物序列特异性PCR（PCR-SSP）的方法分别对226例新疆维吾尔族活动性肺结核患者及231例有结核分枝杆菌接触史的新疆维吾尔族健康者研究MBL基因的H/L、P/Q多态性位点与新疆维吾尔族人群结核病易感性的关系。结果新疆维吾尔族结核病例组中MBL-H/L突变基因型频率与新疆维吾尔族健康对照组突变基因型频率分别为25.66%、18.18%,差异无统计学意义（OR=1.600,95%CI：1.020～2.511,P=0.040,Pc=0.052〉0.05）。新疆维吾尔族结核病例组中MBL-P/Q突变基因型频率与新疆维吾尔族健康对照组突变基因型频率分别为10.62%、10.82%,差异无统计学意义（OR=0.979,95%CI：0.541~1.797,P=0.050,Pc=0.994〉0.05）。MBL-AB等位基因型与MBL-HL等位基因在病例组的相交系数为0.018,P值为0.006〈0.05。新疆维吾尔族人群MBL-A/B,H/L,P/Q之间测出4个单倍体型：HPA,LPA,LPB,LQA。结论新疆维吾尔族人群中MBL基因H/L、P/Q多态性与结核病易感性无明显相关性。新疆维吾尔族人群MBL-A/B,H/L,P/Q等位基因型之间存在连锁不平衡,MBL-A/B等位基因型与MBL-H/L等位基因有正向交互作用。

结核病易感性相关基因-MBL基因的研究进展

结核病是人类最古老的传染病之一,是由结核分枝杆菌引起的一种世界性传染病,是人类健康的重要杀手。据2000年我国第四次全国结核病流行病学抽样调查结果表明：我国活动性肺结核病患病率、涂阳率和死亡率分别为367/10万,106/10万和9.8/10万,结核病疫情在我国仍较为严峻,

汉族人MBL基因ExonI54位密码子点突变及其血浆含量相关性研究

目的 :建立检测MBL基因 5 4位密码子点突变的方法 ,初步调查健康汉族人MBL基因 5 4位密码子点突变的情况 ,检测其血浆MBL含量 ,找出二者的相关性。方法 :根据MBL基因序列设计引物建立MBL基因点突变检测方法即PCR -RFLP ;用MBLOligomerELISA试剂盒测定出血浆MBL的浓度。结果 :建立了特异敏感的检测MBL基因 5 4位密码子点突变的方法 ,测得健康汉族人基因突变频率为 0 .2 32 1 ;健康汉族人血浆MBL含量的平均值为1 999μg/L ,标准差为 1 5 0 5 ;健康汉族人血浆MBL含量与其编码基因Exon 1 5 4位密码子的点突变频率呈负相关 ,χ2 =4 8.1 0 7,P <0 .0 0 1 ;r =- 0 .6 2。结论 :所建立的MBL的PCR -RFLP测定点突变的方法 ,特异性高 ,重复性好 ,较为灵敏 (最低检出量为 1 6 0 pgDNA) ;初步测定了健康汉族人的基因突变频率及其血浆MBL含量 ,二者呈负相关。

中国人MBL基因编码区的克隆与原核表达

目的克隆中国人MBL基因编码区序列,并在原核细胞中表达。方法提取肝总RNA,RT-PCR扩增MBL编码区序列,并克隆到pGEM-T-easy载体上,再亚克隆到pET-30(a)上。诱导表达重组MBL,并通过SDS-PAGE检测表达情况,表达蛋白经初步纯化后,用ELISA及点杂交试验检测其免疫原性。结果克隆得到长747bp的MBL编码区序列,与GenBank中的MBL序列同源性在99%以上。重组MBL相对分子质量约为36000,以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白量的20%左右,表达蛋白经初步纯化,纯度可达95%以上。ELISA检测显示重组MBLA490值与阴性对照差异有显著意义(10倍以上),点杂交检测结果为阳性。结论已成功克隆中国人MBL基因的编码区序列,并在大肠杆菌中表达,表达产物与天然MBL具有相似的免疫原性。

MBL基因多态性与结核病易感性之间的关系

目的探讨MBL与MASP-2的基因多态性与结核易感性之间的关系,为相关防治工作的开展提供了依据。方法随机选取2017年2月至2018年2月来我院就诊的结核病患者60例作为研究对象,比较其与对照组rs7096206/rs2273346/rs6695096等三个位点单核苷酸多态性的差异。结果rs6695096位点的单核苷酸多态性与结核病易感性之间不存在关联,而rs7096206位点GC基因型患者感染结核的风险是CC者的1.39倍(95%CI 1.21~1.67),rs6695096 TC基因型患者感染结核的风险是TT者的1.64倍(95%CI 1.56~1.78)。结论血清甘露糖结合凝集素(MBL)与MBL相关丝氨酸蛋白酶-2(MASP-2)相关基因多态性与结核病易感性之间存在关联.

马槟榔甜蛋白基因(MBLⅡ)的拼接与表达载体的构建

从云南植物Capparismasaikai中提取总DNA,设计引物克隆马槟榔甜蛋白基因MBLⅡ,序列测定后经同源性分析表明与GeneBank中登陆的马槟榔甜蛋白基因MBLⅡ(cDNA)序列一致,表明MBLⅡ不存在内含子序列。利用重叠区扩增基因拼接法(genesplicingbyoverlapextension,geneSOEing)进行体外基因剪接,剪接片段与植物表达载体pVKH相连,构建pVKH-35S-MBLⅡ-Pa、pVKH-35S-S-A+B-pA、pVKH-35S-A+B-pA、pVKH-35S-S-A-pA、pVKH-35S-S-B-pA,为寻找mabinlin的活性表达形式和翻译后剪接机制打下基础。

牛MBL1基因启动子区单核苷酸多态性

为研究牛甘露糖结合凝集素1(mannose-binding lectin 1,MBL1)基因启动子区单核苷酸多态性,采用聚合酶链式反应限制片长多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism,SSCP)及直接测序的方法检测了1 073头中国荷斯坦奶牛、69头鲁西黄牛和24头渤海黑牛启动子区-2194(A>C)、-1446(T>C)、-1330(G>A)三个位点的不同基因型分布。结果表明,在-2194位点和-1330位点处渤海黑牛只检测到两种基因型(AA/AC,GG/GA);而鲁西黄牛群体中在-1330位点处没有检测到AA型。三个品种牛群在该三个位点的优势等位基因相同,分别为A、C、G,频率为A(CH 0.900 1/LYC 0.760 9/BBC 0.937 5)、C(CH 0.604 8/LYC 0.768 1/BBC 0.625)和(CH 0.725 1/LYC0.869 6/BBC 0.895 8)。三个品种牛的优势等位基因相对保守,需进一步研究分析这3个多态位点与牛生产性状的关系。

人野生型MBL基因在大肠杆菌中的表达

为获得人MBL蛋白,并对其功能进行初步研究,用DNA重组法构建了组氨酸标签融合原核表达质粒pET 28(b)-MBL。将重组质粒转入大肠杆菌BI21(DE3),经IPTG在37℃条件下诱导培养,利用SDS-PAGE、Westem-blot检测目的蛋白的表达,用IMAC金属螯合层析柱对其进行纯化。成功地表达了重组MBL蛋白,纯化的MBL浓度约为844μg/mL,为制备MBL的基因工程抗体奠定了基础。

猪MBL2基因序列特征分析

研究采用生物信息学方法分析了猪MBL2基因,进一步获得猪MBL2基因序列特征及编码蛋白的结构和功能,并且对CDS区里的编码蛋白的理化性质进行了预测。除此之外还对这些编码蛋白是亲水还是疏水、它们的糖基化位点、信号肽、二级结构以及三级结构进行了预测。实验结果表明,猪的MBL2基因的大小是723 bp,编码的氨基酸共有240个,蛋白质的相对分子质量为25522.83 KDa,理论等电点PI为4.97。MBL2基因的二级结构是无规则的卷曲型,蛋白结构预测结果是一种可溶性蛋白,具有4个外显子;在第20-21位氨基酸之间存在信号肽,表现为亲水性。研究结果为进一步研究猪MBL2基因的功能提供了理论基础。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药特征及其耐药机制的研究

目的探讨耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药特征及其耐药机制。方法收集2016年1月至2017年12月东莞地区2家医院110株耐亚胺培南铜绿假单胞菌,采用VITEK2系统分析临床菌株耐药性,脉冲场凝胶电泳(PFGE)行同源性分析,PCR法检测金属β?内酰胺酶相关基因以及oprD基因,并对阳性株进行测序;对oprD基因无中断突变株,利用qRT?PCR检测其mRNA表达情况。结果 110株耐亚胺培南铜绿单胞菌PFGE分析结果显示高度克隆多样性。PCR法检测出18株金属β?内酰胺酶基因阳性的菌株,主要类型是:IMP?25,VIM?2,SIM?2。PCR法检测出107株阳性菌株,测序结果表明有意突变率高达93.46%(100/107),类型包括点突变,缺失突变,插入突变以及提早终止突变。7株oprD mRNA表达量均降低。结论本实验进一步证实了oprD基因缺失,发生广泛有意突变,mRNA表达减少以及金属β?内酰胺酶基因产生是铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要机制。