双膦酸盐修饰生长分化因子5促进MC3T3-E1细胞的成骨分化

背景:生长分化因子5作为骨形态发生蛋白的一员在软骨及骨组织修复领域表现出良好的应用潜力,增强生长分化因子5与骨组织的亲和力是提高蛋白使用效率的关键,因而开发具有骨靶向性的生长分化因子5蛋白具有重要意义。目的:利用双膦酸盐修饰生长分化因子5并探讨改性后蛋白对小鼠成骨前体细胞生长分化的影响。方法:采用化学交联法将生长分化因子5与帕米膦酸钠偶联,得到偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5,采用傅里叶变换红外光谱、圆二色谱对其基团及结构进行表征,利用ELISA试剂盒测定生长分化因子5与磷酸钙的结合量以及生长分化因子5的体外释放量,用于表征其体外骨靶向性。将生长分化因子5(对照组)、偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5(实验组)分别与成骨前体细胞MC3T3-E1共培养,以单独培养的细胞为空白对照,评价复合物对细胞增殖及分化等的影响。结果与结论:①红外光谱及圆二色谱结果表明,实验成功制备了双膦酸盐/生长分化因子5复合物且蛋白二级结构无显著变化;体外磷酸钙吸附结果表明,偶联帕米膦酸钠后,生长分化因子5与磷酸钙的吸附率增加了约1倍;在半胱氨酸存在条件下,偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5的蛋白可释放出来;②CCK-8实验结果显示,实验组培养4,7 d的吸光度值高于对照组、空白对照组(P<0.0001);培养7 d后,实验组碱性磷酸酶表达明显高于对照组、空白对照组(P<0.0001);培养13 d后,实验组钙结节含量明显高于对照组、空白对照组(P<0.0001);qRT-PCR结果检测结果显示,培养7 d后,实验组碱性磷酸酶、骨钙素及Runx2的mRNA表达高于对照组、空白对照组(P<0.01,P<0.001,P<0.0001);③结果表明,双膦酸盐修饰有利于增强生长分化因子5与磷酸钙的结合能力,同时有利于增强其生物活性。

淫羊藿苷在炎症环境下对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响

背景:研究表明慢性根尖周炎是常见的炎症性骨破坏疾病之一,淫羊藿苷可以促进成骨分化、抑制骨吸收,可能对慢性根尖周炎引起的骨破坏起到保护作用。目的:探讨在脂多糖刺激的炎症环境下淫羊藿苷对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响。方法:应用脂多糖刺激MC3T3-E1细胞建立体外炎症环境,采用CCK-8检测脂多糖最佳作用质量浓度及作用时间;CCK-8检测在1μg/mL脂多糖刺激下淫羊藿苷的最佳作用质量浓度;碱性磷酸酶染色、Real-time PCR及Western blot检测炎症环境下淫羊藿苷对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响;Real-time PCR及Western blot检测炎症环境下淫羊藿苷对MC3T3-E1细胞炎症相关因子白细胞介素1β、白细胞介素6表达的影响。结果与结论:①CCK-8结果显示,淫羊藿苷的最佳作用质量浓度为0.1μg/mL;②在炎症环境下,淫羊藿苷增强了碱性磷酸酶的表达,促进了成骨细胞分化;③与脂多糖组相比,脂多糖+淫羊藿苷组成骨相关因子碱性磷酸酶、Runx2表达升高;④与脂多糖组相比,脂多糖+淫羊藿苷组炎症相关因子白细胞介素1β、白细胞介素6表达水平下降;⑤结果提示,脂多糖能导致MC3T3-E1细胞成骨分化能力减弱并加重炎症反应,淫羊藿苷对其具有保护作用。

高糖环境下药桑提取物脱氧野尻霉素对MC3T3-E1细胞的影响

目的研究药桑提取物脱氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin,DNJ)在高糖环境下对MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化的作用。方法取P4代MC3T3-E1细胞,在50 mmol/L的高糖环境下通过细胞毒性检测试剂盒(Cell dountingkit-8,CCK-8)检测不同浓度的DNJ(10 mmol/L、1 mmol/L、100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L、100 nmol/L、10 nmol/L、1 nmol/L)干预对MC3T3-E1细胞增殖的影响,筛选出后续实验研究的DNJ浓度。取培养至对数生长期的MC3T3-E1细胞,按不同干预方式分为:空白组(完全培养基)、高糖组(50 mmol/L糖浓度的完全培养基)、实验组[50 mmol/L糖浓度的完全培养基+不同浓度DNJ(100、10、1μmol/L)溶液]。使用流式细胞技术检测细胞的凋亡和活性氧,采用ELISA试剂盒检测细胞上清液中AGEs和IL-1β、IL-6、TNF-α的含量,通过碱性磷酸酶染色及活性检测MC3T3-E1细胞的早期成骨能力的影响,通过茜素红染色和定量检测MC3T3-E1细胞的晚期成骨能力,采用RT-PCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α、Bax、Bcl-2、IGF-1、ALP、OCN、OSX、Col-1和Runx2的mRNA表达情况。结果高糖环境下,100、10、1μmol/L的DNJ可以促进MC3T3-E1细胞增殖。与高糖组相比,实验组凋亡率、活性氧含量、细胞上清液中AGEs、IL-1β、IL-6和TNF-α含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR结果表明,与高糖组相比,实验组Bax、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达降低,Bcl-2、IGF-1、ALP、OCN、OSX、Col-1和Runx2的mRNA表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在高糖环境下,一定浓度范围内DNJ能够抑制MC3T3-E1细胞的凋亡和炎症因子的产生,促进成骨细胞的分化。

温度对过氧化氢抑制前成骨细胞MC3T3-E1细胞增殖和成骨分化的影响

目的探讨温度对过氧化氢(H_(2)O_(2))抑制前成骨细胞增殖和成骨分化的影响。方法取对数生长期MC3T3-E1细胞,随机分为0、450、500、550、600、650μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)干预组,分别给予0、450、500、550、600、650μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)溶液干预2 h。另取对数生长期MC3T3-E1细胞,随机分为对照组、模型组、低温组和高温组。对照组细胞置于37℃、含体积分数5%CO_(2)培养箱中孵育24 h;模型组细胞置于37℃、含体积分数5%CO_(2)培养箱中孵育24 h,并给予H_(2)O_(2)刺激2 h;低温组细胞置于32℃、含体积分数5%CO_(2)培养箱中孵育24 h,并给予H_(2)O_(2)刺激2 h;高温组细胞置于40℃、含体积分数5%CO_(2)培养箱中孵育24 h,并给予H_(2)O_(2)刺激2 h。采用细胞计数试剂盒-8检测各组细胞增殖能力,实时荧光定量聚合酶链反应法检测细胞中Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OC)mRNA表达水平,Western blot法检测MC3T3-E1细胞中RUNX2、OPN和OC蛋白表达水平。结果0、450、500μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)干预组细胞增殖率比较差异无统计学意义(P>0.05);550、600、650μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)干预组细胞增殖率显著低于0、450、500μmol·L^(-1)H_(2)O_(2)干预组,且随H_(2)O_(2)浓度增加细胞增殖率显著降低(P<0.05)。为保证后续实验有足够的细胞,选择H_(2)O_(2)的干预浓度为550μmol·L^(-1)。模型组和低温组细胞增殖率显著低于对照组和高温组,低温组细胞增殖率显著低于模型组(P<0.05);对照组与高温组细胞增殖率比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组和高温组细胞中RUNX2 mRNA相对表达量显著高于对照组和低温组,低温组细胞中RUNX2 mRNA相对表达量显著低于对照组(P<0.05);模型组与高温组细胞中RUNX2 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组、低温组和高温组细胞中OPN mRNA相对表达量显著高于对照组,低温组和高温组细胞中OPN mRNA相对表达量显著高于模型组,低温组细胞中OPN mRNA相对表达量显著高于高温组(P<0.05)。模型组、低温组和高温组细胞中OC mRNA相对表达量显著高于对照组,低温组和高温组细胞中OC mRNA相对表达量显著高于模型组(P<0.05);低温组与高温组细胞中OC mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组、低温组和高温组细胞中RUNX2、OPN和OC蛋白相对表达量显著低于对照组(P<0.05)。低温组细胞中RUNX2、OPN蛋白相对表达量显著低于模型组和高温组,OC蛋白相对表达量显著低于高温组(P<0.05);低温组与模型组细胞中OC蛋白相对表达量比差异无统计学意义(P>0.05)。高温组细胞中RUNX2、OPN和OC蛋白相对表达量显著高于模型组(P<0.05)。结论H_(2)O_(2)可抑制MC3T3-E1细胞增殖和成骨分化,低温可增强H_(2)O_(2)对MC3T3-E1细胞增殖和成骨分化的抑制作用,高温可缓解H_(2)O_(2)对细胞增殖和成骨分化的抑制作用。RUNX2、OPN和OC蛋白可能在温度调控细胞增殖和成骨分化的过程中发挥重要作用。

祛湿健骨方对MC3T3-E1细胞成骨分化能力的促进作用研究

目的探讨祛湿健骨方对MC3T3-E1细胞的作用机理。方法将祛湿健骨方配成不同浓度溶液(0.005、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL),用不同浓度祛湿健骨方对细胞进行干预,干预48 h后,采用CCK-8法检测细胞增殖率,筛选最佳药物浓度。将MC3T3-E1细胞制成细胞悬液,随机分为对照组、地塞米松组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,接种至六孔板。待细胞贴壁达到80%后进行造模(对照组不添加药物;地塞米松组使用地塞米松干预;低剂量组、中剂量组、高剂量组分别用相应浓度的祛湿健骨方+地塞米松进行干预)48 h后更换为成骨诱导培养基进行培养。诱导15 d后,测定各组细胞的碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)含量和Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)、骨细胞特异性转录因子(Osterix,OSX)蛋白的表达量。结果经CCK-8实验结果对比,药物筛选前3位存活率浓度为0.1 mg/mL(低浓度)、0.2 mg/mL(中浓度)、0.4 mg/mL(高浓度)。与对照组相比,地塞米松组、低剂量组、中剂量组、高剂量组细胞ALP活性均降低差异有统计学意义(P<0.05);与地塞米松组相比,低剂量组、中剂量组差异无统计学意义(P>0.05),高剂量组细胞ALP活性升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,中剂量组、低剂量组、地塞米松组细胞的RUNX2、OSX蛋白表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05),高剂量组细胞OSX和RUNX2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与地塞米松组比较,高剂量组OSX和RUNX2蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.05)。结论祛湿健骨方能够促进MC3T3-E1细胞的成骨分化能力,其可能是通过调节RUNX2、OSX等骨形成相关蛋白,以此纠正骨形成与骨吸收的平衡,达到治疗骨质疏松症的作用。

龙血素B通过P38MAPK信号通路调控MC3T3-E1成骨分化和骨形成的机制

目的:探究龙血素B对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1细胞)成骨分化和骨形成的影响以及其通过P38MAPK信号通路调控成骨分化和骨形成的机制。方法:培养MC3T3-E1细胞,加入不同浓度(0、15、30、60、90、120μmol/L)龙血素B,采用CCK8法和流式细胞术(FCM)检测不同时间(24h、48h、72h)MC3T3-E1细胞增殖能力和凋亡情况,确定龙血素B促MC3T3-E1细胞成骨最佳的药物浓度及作用时间。培养MC3T3-E1细胞并分为空白组(不作干预),龙血素B组(加入龙血素B共培养),龙血素B+阻断剂组(加入龙血素B和P38抑制剂SB203580共培养),进行干预实验;采用碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒测定各组细胞ALP活性,qRT-PCR法检测各组细胞骨桥蛋白(OPN)基因、骨钙素(OCN)基因、骨唾液蛋白(BSP)基因表达水平,茜素红染色法观察各组细胞骨形成能力。结果:龙血素B可促进MC3T3-E1细胞增殖并抑制其凋亡,效果与浓度和干预时间相关,在90μmol/L浓度下干预48h促MC3T3-E1细胞生长作用最强;干预结束后第1、3、5天,龙血素B组细胞ALP活性较空白组升高,龙血素B+阻断剂组细胞ALP活性较龙血素B组降低(P<0.05);龙血素B组细胞OPN、OCN、BSP基因表达水平较空白组升高,龙血素B+阻断剂组细胞OPN、OCN、BSP基因表达水平较龙血素B组降低(P<0.05);干预结束后第21天,龙血素B组细胞钙化结节区域面积较空白组增大,龙血素B+阻断剂组细胞钙化结节区域面积较龙血素B组减小(P<0.05)。结论:龙血素B可提高MC3T3-E1细胞增殖活性,并通过激活P38MAPK信号通路促进MC3T3-E1细胞成骨分化和骨形成。

Nesfatin-1对3T3-L1脂肪细胞糖代谢和自噬的影响

为探讨厌食肽Nesfatin-1对脂肪细胞糖代谢和自噬的影响,本试验通过体外诱导分化3T3-L1前脂肪细胞,并在高糖状态下,以Nesfatin-1干预1 h之后,采用非放射性荧光法、ELISA、实时荧光定量PCR和Western blot分别检测脂肪细胞的葡萄糖摄取水平、丙酮酸含量、己糖激酶和磷酸果糖激酶活性以及自噬因子LC3、p62和Beclin-1 mRNA和蛋白表达量。结果显示,3T3-L1前脂肪细胞经过8 d诱导可达到完全分化状态;与对照组相比,经过Nesfatin-1处理后,3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取水平极显著降低(P<0.01),己糖激酶和磷酸果糖激酶的酶活性均非常显著地降低(P<0.001),p62 mRNA和蛋白表达量极显著下降(P<0.01),但丙酮酸含量、Beclin-1 mRNA以及LC3 mRNA和蛋白表达量差异不显著(P>0.05)。结果提示,Nesfatin-1不仅能有效降低3T3-L1脂肪细胞的糖消耗能力,还能上调脂肪细胞的自噬水平。

不同成骨诱导体系对MC3T3-E1成骨分化的影响

目的:明确前成骨细胞MC3T3-E1最佳体外成骨诱导体系。方法:构建不同成骨诱导体系,分别为A组地塞米松0.1μmol/L、抗坏血酸50μg/mL及β-甘油磷酸钠10 mmol/L;B组地塞米松0.01μmol/L、抗坏血酸50μg/mL及β-甘油磷酸钠10 mmol/L;C组地塞米松1μmol/L、抗坏血酸50μg/mL及β-甘油磷酸钠10 mmol/L;D组抗坏血酸50μg/mL及β-甘油磷酸钠10 mmol/L;E组抗坏血酸100μg/mL及β-甘油磷酸钠5 mmol/L。对MC3T3-E1进行为期7 d、14 d的体外成骨诱导,通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色对在不同成骨诱导体系作用下MC3T3-E1成骨分化的影响进行分析,通过RT-qPCR检测成骨分化相关基因ALP、Runx2、COL-1、OCN、OPN表达水平,比较不同成骨诱导体系的诱导性能。结果:B、D和E组茜素红定量最优,差异具有统计学意义(P<0.05),诱导7 d的RT-qPCR结果显示C组ALP、Runx2、COL-1的基因表达量最高(P<0.05)。诱导14 d的RT-qPCR结果显示:OCND组表达最高(P<0.05)。结论:地塞米松和抗坏血酸的浓度均对MC3T3-E1的成骨分化产生影响,C组1μmol/L地塞米松、50μg/mL抗坏血酸与10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠早期成骨更佳,选择其作为早期成骨验证,D组50μg/mL抗坏血酸与10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠晚期成骨更佳,但综合考虑,建议B组0.01μmol/L地塞米松、50μg/mL抗坏血酸与10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠成骨诱导体系用于MC3T3-E1体外晚期成骨研究。

微小RNA-214靶向调控PTEN对成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化、矿化的影响及机制研究

目的:探讨微小RNA-214(miR-214)靶向调控第10号染色体丢失性磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)对成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化、矿化的影响及机制。方法:将成骨细胞MC3T3-E1分为miR-124 mimic组(转染miR-124 mimic)、miR-124 NC组(转染miR-124 NC)、pcDNA3.1-PTEN组(转染pcDNA3.1-PTEN)、miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN组(转染miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN)。采用在线生信预测miR-124和PTEN靶向结合位点,通过双荧光素酶报告基因进行验证。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测细胞miR-124和PTEN mRNA表达。采用CCK-8法检测细胞增殖。采用碱性磷酸酶活性测定检测细胞分化能力。采用茜素红染色和骨钙素水平测定检测细胞的矿化。采用Werstern blot检测PTEN、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、骨桥蛋白(OPN)、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)水平。结果:与miR-124 NC组比较,miR-124 mimic组野生型PTEN的荧光素酶活性降低(均P<0.05)。与miR-124 NC组比较,miR-124 mimic组miR-124及p-PI3K、p-AKT蛋白表达升高,PTEN mRNA和蛋白、细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、ColⅠ和OPN蛋白、细胞矿化率和骨钙素水平降低,而pcDNA3.1-PTEN组则相反(均P<0.05)。与miR-124 mimic组比较,miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN组p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低,PTEN mRNA和蛋白、细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、ColⅠ和OPN蛋白、细胞矿化率和骨钙素水平升高(均P<0.05)。结论:miR-214通过靶向下调PTEN蛋白表达激活PI3K/AKT信号通路,从而调控成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化。

HECTD1调控PI3K/AKT信号通路对低氧诱导的脑微血管内皮细胞损伤的影响

目的探讨低氧应激下HECT结构域E3泛素连接酶1(HECTD1)对脑微血管内皮细胞(BMECs)的影响及其功能机制。方法BMECs细胞在1%O_(2)的条件下培养以诱导低氧刺激。使用多种细胞生物学功能实验测定来评估BMECs中低氧诱导的损伤。乳酸脱氢酶(LDH)、总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(T-SOD)水平的检测以评估低氧诱导的氧化应激水平。Western blot检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。结果在常氧条件下,过表达HECTD1可以提高BMECs的细胞活力。在低氧条件下,过表达HECTD1显著减轻了低氧诱导的细胞活力抑制作用。此外过表达HECTD1降低了低氧诱导的BMECs细胞凋亡和氧化应激。结论HECTD1通过阻断PI3K/AKT信号通路来保护BMECs免受低氧应激诱导的损伤,这表明HECTD1在低氧相关的脑疾病中具有治疗价值。

人牙周膜干细胞来源外泌体干预成骨细胞MC3T3-E1的增殖和分化

背景:人牙周膜干细胞具有较强的成骨分化能力,人牙周膜干细胞来源外泌体作为牙周膜干细胞分泌的主要成分,对成骨细胞MC3T3-E1增殖和成骨分化的影响尚不明确。目的:探讨人牙周膜干细胞来源外泌体对MC3T3-E1细胞增殖和分化的影响。方法:采用酶消化法分离及培养人牙周膜干细胞,超速离心法提取人牙周膜干细胞来源外泌体,通过透射电镜、粒径分析及Western blot方法对人牙周膜干细胞来源外泌体进行鉴定;CCK8法检测不同质量浓度人牙周膜干细胞来源外泌体对MC3T3-E1细胞增殖的影响,茜素红染色观察100 mg/L人牙周膜干细胞来源外泌体对MC3T3-E1细胞成骨矿化的影响,Western blot检测100 mg/L人牙周膜干细胞来源外泌体干预前后MC3T3-E1细胞内MEK和ERK的磷酸化水平。结果与结论:①透射电镜观察可见外泌体为脂质双分子层形成的囊泡结构,粒径检测显示外泌体直径分布在50-120 nm,集中在79.86 nm,Western blot检测结果显示提取的外泌体中含有CD81,CD63,TSG101的表达;②与对照组相比,人牙周膜干细胞来源外泌体对MC3T3-E1细胞的增殖具有促进作用,且作用呈剂量依赖性;③与对照组相比,人牙周膜干细胞来源外泌体组MC3T3-E1细胞能够形成更多的钙结节;与对照组相比,人牙周膜干细胞来源外泌体组MC3T3-E1细胞内p-MEK及p-ERK蛋白表达量升高;④结果表明,人牙周膜干细胞来源外泌体可以显著促进MC3T3-E1增殖和成骨分化,推测可能与其激活MEK/ERK信号通路有关。

SLA-Bio处理对纯钛表面MC3T3-E1细胞黏附行为的影响

目的在传统喷砂酸蚀(SLA)处理基础上对纯钛表面进行喷砂、蚀刻和生物矿化(SLA-Bio)处理,观察其表面MC3T3-E1前成骨细胞的黏附铺展行为,以期为纯钛种植体表面改性提供更多研究方向。方法将纯钛片分为SLA组(TiO_(2)砂粒喷砂+HCI/H_(2)SO_(4)混合液酸蚀)和SLA-Bio组(SLA处理后再进行矿化处理14 d),通过SEM-EDS观察钛片表面形貌并分析其表面元素构成。于2组钛片表面接种MC3T3-E1细胞,分别于接种后1 h、6 h、24 h取出钛片,MTT法计算并比较2组钛片表面细胞黏附率,通过荧光染色观察、Image Pro Plus软件分析计算,比较不同表面MC3T3-E1细胞铺展行为及形态因子的差异。结果SLA组钛片表面呈蜂窝状、大小不一、深浅不等的不规则孔洞结构,SLA-Bio组钛片表面可见多孔微纳米球状羟磷灰石(hydroxyapatite,HA)沉积物,球体表面可见针状纳米微粒;MC3T3-E1细胞接种后1 h、6 h、24 h时,SLA-Bio组细胞黏附率均明显高于SLA组(P<0.05),SLA-Bio组细胞形态因子均明显低于SLA组(P<0.05);细胞荧光染色结果显示,与SLA组相比,SLA-Bio组在接种后各个时间段均呈现更好的黏附伸展形态。结论SLA-Bio处理可在纯钛表面形成多孔微纳米球状HA沉积物;SLA-Bio表面较SLA表面更有利于MC3T3-E1细胞的黏附和伸展,可能促进种植体骨结合的过程。

栀子苷调节PI3K/AKT/mTOR信号通路在动脉粥样硬化形成过程中对Th17/Treg功能的影响

目的:观察栀子苷对载脂蛋白E缺乏(ApoE^(-/-))小鼠Th17/调节性T(Treg)细胞失衡的影响及其作用机制。方法:将50只纯合子ApoE^(-/-)雌性小鼠随机分为对照组、模型组和栀子苷低剂量组、栀子苷中剂量组、栀子苷高剂量组。对照组小鼠喂养普通饲料,模型组和栀子苷组小鼠喂养高脂饲料。从第8周开始,栀子苷各剂量组每日灌胃栀子苷(25、50、100 mg/kg),连续8周。试验结束时,采用油红O染色评估主动脉及其根部动脉粥样硬化(AS)病变面积比。采用定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析主动脉组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-17A和IL-10 mRNA表达;采用流式细胞仪分析脾脏中Th17和Treg细胞百分比;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测主动脉组织磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白表达。结果:油红O染色病变显示,栀子苷中剂量组、栀子苷高剂量组病变百分比低于模型组(P<0.05)。与对照组比较,模型组主动脉TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表达水平升高(P<0.05);栀子苷各剂量组主动脉TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表达水平降低(P<0.05)。与对照组比较,模型组主动脉抗炎细胞因子IL-10 mRNA表达水平降低(P<0.05);栀子苷各剂量组主动脉抗炎细胞因子IL-10 mRNA表达水平升高(P<0.05)。与对照组比较,模型组小鼠脾脏中Th17细胞百分比升高,Treg细胞百分比降低(P<0.05)。栀子苷处理恢复了AS小鼠Th17和Treg细胞的平衡。栀子苷抑制PI3K的表达及AKT和mTOR的磷酸化,MHY1485(mTOR活化剂)减弱了栀子苷对T细胞分化的影响。结论:栀子苷抗AS作用机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号引起的Treg细胞增多和Th17细胞减少有关。

牛骨肽钙螯合物制备、表征及其促MC3T3-E1细胞成骨活性

目的:为制备人体高效吸收利用的补钙剂并探究其对MC3T3-E1细胞成骨活性的影响。方法:对牛骨多肽进行钙螯合处理,以钙螯合能力为考察指标,通过响应面方法确定最佳制备条件;利用红外光谱、X射线衍射和原子吸收等方法探究肽钙螯合物的结构特性及其稳定性;通过细胞实验探究牛骨肽钙螯合物对MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化活性的影响。结果:制备牛骨肽钙螯合物的最佳条件为肽钙质量比2.97∶1、温度62.54℃、pH 9.06。在该条件下,钙螯合能力达到55.65μg/mg。光谱结构分析结果表明氨基氮、羟基氧和羧基氧是钙主要螯合位点,二者之间主要通过配位键结合,且肽螯合钙后分子质量增加;此外,牛骨肽钙螯合物稳定性受温度影响较小,但对pH值较敏感。MC3T3-E1细胞实验结果表明肽钙螯合物具有明显促MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化活性的作用。结论:制备的牛骨肽钙螯合物具有潜在的促MC3T3-E1细胞成骨活性功效。

松油烯4醇的抑菌性及促进MC3T3-E1细胞成骨分化作用

背景:有研究发现,松油烯4醇对于种植体周围炎相关致病菌表现出明显的抑菌活性,当应用于钛种植体表面时能有效减少表面生物膜形成,降低种植体周围炎的发生,但是有关其生物安全性的研究不多。目的:分析松油烯4醇对金黄色葡萄球菌、变异链球菌的抗菌效果,以及其对MC3T3-E1细胞生长与成骨分化的影响。方法:将松油烯4醇以不同体积分数溶于二甲基亚砜中,检测松油烯4醇溶液对金黄色葡萄球菌和变异链球菌的最低抑菌浓度及最低杀菌浓度,并采用抑菌圈实验检测1/2最低抑菌浓度、最低抑菌浓度及最低杀菌浓度松油烯4醇的抗菌效果。以不同浓度(0%,0.3%,0.2%,0.1%,均为体积分数)松油烯4醇的培养基或钙化诱导液处理MC3T3-E1细胞,采用CCK-8实验检测细胞的增殖活性,罗丹明-鬼笔环肽染色观察细胞骨架,碱性磷酸酶活性实验检测细胞分化能力,茜素红染色观察矿化结节形成,RT-PCR检测Runx2、骨钙素mRNA的表达。结果与结论:①松油烯4醇溶液对变异链球菌的最低抑菌浓度为0.1%、最低杀菌浓度为0.4%,对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.03%、最低杀菌浓度为0.125%;随着浓度的增加,松油烯4醇溶液对两种细菌的抑菌圈直径增加(P<0.05);②CCK-8实验显示,松油烯4醇可促进MC3T3-E1细胞的增殖,其中以浓度0.2%组最明显;③罗丹明-鬼笔环肽染色显示,松油烯4醇可促进MC3T3-E1细胞的黏附;④碱性磷酸酶活性与茜素红染色显示,松油烯4醇均可促进MC3T3-E1细胞的早期分化与矿化,其中以浓度0.2%组最明显;⑤RT-PCR检测显示,钙化诱导1 d时,0.3%,0.2%,0.1%组Runx2 mRNA的表达高于0%组(P<0.05);钙化培养7,14 d时,0.2%,0.1%组Runx2、骨钙素mRNA的表达高于0.3%,0%组(P<0.05);⑥结果表明,松油烯4醇可以抑制金黄色葡萄球菌及变异链球菌的生长,促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化和矿化。

柚皮苷通过调控RAW264.7细胞功能影响MC-3T3-E1细胞的成骨分化

背景:柚皮苷作为一种中药单体,具有抗炎、促进成骨和抗癌等作用;RAW264.7巨噬细胞在骨破坏过程中发挥重要作用。有研究发现降低炎症水平可以促进MC-3T3-E1细胞的成骨分化,所以通过抑制炎症相关通路,可能对成骨细胞分化具有促进作用。目的:观察柚皮苷通过调控RAW264.7细胞功能是否会影响MC-3T3-E1细胞的成骨分化。方法:采用CCK-8法检测不同浓度柚皮苷对脂多糖诱导的RAW264.7细胞的毒性。将RAW264.7细胞分成7组:即对照组(DMEM培养基)、炎症模型组(1 mg/L脂多糖)和柚皮苷组(1 mg/L脂多糖+50,100,150,200,250μmol/L柚皮苷),通过RT-PCR检测炎症因子m RNA水平变化,筛选出抗炎浓度较好的3组(150,200,250μmol/L柚皮苷组)数据用于后续实验。将RAW264.7细胞分成4组:炎症模型组、150,200,250μmol/L柚皮苷组分别取各组的上清液制备炎症上清液。最后将上述制取的炎症上清液与成骨诱导培养基1∶1比例混合共同培养MC-3T3-E1细胞并分为5组:对照组、炎症模型组、150,200,250μmol/L柚皮苷组,培养7,14 d进行成骨相关基因的检测,并进行碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性实验。结果与结论:①1 mg/L的脂多糖对巨噬细胞无毒性作用,200μmol/L柚皮苷对脂多糖诱导的巨噬细胞有细胞毒性作用(P<0.05);②筛选药物抗炎浓度过程中,与对照组相比柚皮苷浓度为150,200,250μmol/L时抗炎效果较好(P<0.05),此3组浓度用于后续实验;③碱性磷酸酶染色结果显示,与对照组相比柚皮苷浓度200μmol/L时染色效果最好,且14 d比7 d染色效果更佳;④与对照组相比,200μmol/L柚皮苷组的成骨基因mRNA表达水平最接近对照组,成骨效果最差的为炎症模型(P<0.05);⑤碱性磷酸酶活性实验中,7 d时与对照组相比,柚皮苷浓度为200μmol/L时碱性磷酸酶活性最强(P<0.05);与炎症模型组相比,柚皮苷浓度为200μmol/L时最佳(P<0.05);14 d时,与对照组相比,200μmol/L组无显著差异;与炎症模型组相比,200μmol/L组活性最强;⑥以上结果证明,柚皮苷通过调节RAW264.7巨噬细胞功能可改善炎症状态下MC-3T3-E1细胞的成骨分化。

葛根素对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的影响及机制研究

目的:探讨葛根素对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)的影响及可能的作用机制。方法:将3T3-L1脂肪细胞分为7组,即对照组(control组)、葛根素3μmol/L组、葛根素10μmol/L组、葛根素30μmol/L组、葛根素100μmol/L组、葛根素300μmol/L组和阳性对照组(罗格列酮10μmol/L组,RGZ组),每组6孔。采用MTT法检测细胞增殖,油红O染色法检测细胞分化。利用地塞米松诱导建立3T3-L1脂肪细胞IR模型,并给予不同浓度的葛根素进行干预,测定葡萄糖利用情况,利用细胞转染过表达TLR2(命名为Pue+oe-TLR2组);蛋白质免疫印迹法(western blotting)测定TLR2蛋白水平;酶联免疫吸附试验测定干扰素-γ(IFN-γ)水平。结果:与control组相比,葛根素各剂量组3T3-L1脂肪细胞的增殖率均无显著变化(P>0.05)。与control组相比,葛根素各剂量组3T3-L1脂肪细胞的分化明显增加(P<0.05)。与control组相比,葛根素各剂量组IR 3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖消耗量显著提高(P<0.05);葛根素各剂量组IR 3T3-L1脂肪细胞中TLR2表达量、IFN-γ分泌量降低,GLUT4和PPARγ的水平升高(P<0.05)。Pue+oe-TLR2组TLR2的相对表达量及IFN-γ分泌量显著高于Pue+oe-NC组,PPARγ、GLUT4的相对表达量显著低于Pue+oe-NC组(P<0.01)。结论:葛根素可提高IR 3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗,缓解IR,其机制可能与抑制TLR2表达进而降低IFN-γ分泌有关。

L-NMMA对过量氟暴露引起的小鼠MC3T3E1成骨细胞中NO/iNOS表达的影响

目的探讨L-单甲基-精氨酸(L-NMMA)与过量氟化钠(NaF)共培养对小鼠颅顶前成骨(MC3T3E1)细胞中一氧化氮(NO)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响。方法将MC3T3E1成骨细胞分为空白组(只含培养基)、NaF染毒组(0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L)及L-NMMA染毒组(0、5、10、20、40、80 mol/L),采用细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK8)检测细胞存活率,并筛选最佳染氟浓度和最佳L-NMMA用药浓度;再将MC3T3E1成骨细胞分为对照组(0.0 mmol/L NaF)、低氟组(1.0 mmol/L NaF)、高氟组(4.0 mmol/L NaF)、低氟+L-NMMA组(1.0 mmol/L NaF+20μmol/L L-NMMA)、高氟+L-NMMA组(4.0 mmol/L NaF+20μmol/L L-NMMA)、L-NMMA组(20μmol/L L-NMMA),处理24 h,采用硝酸还原酶法检测细胞中NO含量,蛋白免疫印迹法及实时荧光定量PCR法分别检测iNOS蛋白及mRNA表达水平。结果与对照组相比,1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L NaF染毒组及80μmol/L L-NMMA染毒组MC3T3E1成骨细胞存活率降低(P<0.05),选择1.0 mmol/L和4.0 mmol/LNaF为染氟浓度、20μmol/LL-NMMA用药浓度进行后续实验;与对照组比较,低氟组、高氟组MC3T3E1成骨细胞中NO含量增加(P<0.05),低氟+L-NMMA组中NO含量低于低氟组(P<0.05),高氟+L-NMMA组细胞中NO含量低于高氟组(P<0.05);与对照组相比,高氟组MC3T3E1成骨细胞中iNOS蛋白及mRNA表达水平升高(P<0.05);与高氟组比较,高氟+L-NMMA组细胞中iNOS蛋白及mRNA表达水平降低(P<0.05)。结论过量氟可致MC3T3E1成骨细胞损伤、iNOS蛋白和mRNA表达增强、细胞中NO含量增加,L-NMMA与氟共培养后可减弱这一效应,提示L-NMMA对过量氟所致MC3T3E1成骨细胞损伤有一定的保护作用。

多西环素通过MEK/ERK信号通路促进MC3T3-E1细胞株体外成骨分化

目的:研究在体外条件下多西环素(doxycycline,DOX)对前成骨细胞株MC3T3-E1成骨分化的影响及可能机制。方法:在成骨诱导剂体外诱导MC3T3-E1细胞株成骨分化条件下,茜素红染色检测成骨细胞分化;实时定量PCR检测DOX对MC3T3-E1细胞相关成骨基因OCN、Runx2的影响;用DOX、MEK抑制剂(U0126)单独或联合处理MC3T3-E1细胞后,Western blot检测N-cadherin、p-MEK及p-ERK等蛋白的表达。结果:在MC3T3-E1细胞株体外成骨诱导分化中,加入DOX可以增强茜素红染色阳性率。DOX上调MC3T3-E1细胞相关成骨基因OCN、Runx2的表达。DOX处理MC3T3-E1细胞后,其N-cadherin蛋白表达水平下降(P<0.05),p-MEK和p-ERK蛋白的表达增加(P<0.05)。而MEK拮抗剂(U0126)则显著上调N-cadherin蛋白表达水平,同时降低p-MEK、p-ERK水平。用U0126联合DOX处理MC3T3-E1细胞后,DOX对N-cadherin、p-MEK和p-ERK蛋白水平的影响可被U0126拮抗。在MC3T3-E1细胞株体外成骨诱导分化中,同时存在DOX和U0126时,茜素红染色阳性率低于单独DOX组。结论:DOX可以促进MC3T3-E1细胞株的体外成骨分化;而DOX的这一效应可能是通过MEK-ERK信号通路参与完成的。

miR-210-3p通过自噬调控MC3T3-E1细胞成骨分化的机制研究

目的:探讨微小RNA-210-3p(microRNA-210-3p,miR-210-3p)通过自噬对小鼠成骨细胞系MC3T3-E1成骨分化的影响。方法:(1)采用脂质体转染法构建miR-210-3p过表达或沉默的MC3T3-E1细胞模型,设置阴性对照(negative control,NC)mimic组、miR-210-3p mimic组、NC inhibitor组和miR-210-3p inhibitor组,Western blot、RT-qPCR和免疫荧光法检测MC3T3-E1细胞成骨分化相关指标及自噬相关指标的变化,茜素红染色法观察矿化结节形成情况。(2)用雷帕霉素(rapamycin,RAPA)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)分别构建自噬激活和抑制模型,设置control组、RAPA组和3-MA组,Western blot、RT-qPCR和免疫荧光法检测自噬激活或抑制后MC3T3-E1细胞成骨分化相关指标的变化,茜素红染色法观察矿化结节形成情况。(3)设置NC mimic组、NC mimic+RAPA组和miR-210-3p mimic+RAPA组,Western blot和RT-qPCR检测各组MC3T3-E1细胞成骨分化相关指标的变化。结果:(1)与NC mimic组相比,miR-210-3p mimic组细胞成骨分化指标的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05),细胞内Runx2免疫荧光强度升高,矿化结节数目增加,细胞自噬水平显著降低(P<0.05)。与NC inhibitor组相比,miR-210-3p inhibitor组细胞成骨分化指标的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),细胞内Runx2疫荧光强度降低,矿化结节数目减少,细胞自噬水平显著升高(P<0.05)。(2)与control组相比,3-MA组细胞成骨分化指标的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05),细胞内Runx2免疫荧光强度升高,而RAPA组细胞成骨分化指标的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),细胞内Runx2免疫荧光强度降低。(3)miR-210-3p过表达可逆转RAPA对MC3T3-E1细胞成骨分化的抑制作用(P<0.01)。结论:miR-210-3p可通过降低自噬水平促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。