糖皮质激素在MCAO大鼠海马神经元凋亡中的作用及健脑安干预的研究

目的 :观察脑缺血再灌注后 2 4h内的内源性糖皮质激素对海马神经细胞凋亡的影响及中药对此的干预。方法 :应用大脑中动脉阻塞 (MCAO)模型 ,采取甲苯胺兰、TUNEL和免疫组化实验方法 ,动态观察脑缺血再灌注后 2 4h内的内源性糖皮质激素对大鼠海马神经细胞凋亡的影响及中药对此的干预。结果 :TUNEL阳性细胞从再灌注 2h开始表达 ,再灌注 6h阳性细胞表达继续增加 ,再灌注 12h达高峰 ,再灌注 2 4h下降。治疗组、对照组、拮抗剂组与模型组在再灌注各时点均有显著性差别 (P <0 .0 5 ,) ,其中治疗组和拮抗剂组差异极显著 (P <0 .0 1)。结论 :健脑安可有效抑制脑缺血再灌注 2 4内 ,内源性糖皮质激素对海马神经元的促凋亡作用。

Anle138b对oAβ_(1-42)诱导大鼠海马神经元线粒体功能损伤的影响

目的探究Anle138b对慢性β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的海马神经元线粒体功能损伤的影响。方法取出生24 h以内的SD乳鼠,原代培养海马神经元,待细胞成熟将其分为对照组(不进行任何处理)、oAβ_(1-42)组(100 nmol/L oAβ_(1-42)处理7 d)、oAβ_(1-42)+Anle138b组(100 nmol/L oAβ_(1-42)+100 nmol/L Anle138b共处理7 d)、Anle138b组(100 nmol/L Anle138b处理7 d)。各组处理结束后,应用流式细胞术检测活性氧(ROS)和线粒体膜电位(Δψm)阳性细胞的变化。结果析因设计的方差分析显示,oAβ_(1-42)和Anle138b的主效应明显(F_(oAβ1-42)=14.149、38.209,F_(Anle138b)=1.942、24.871,P<0.01),oAβ_(1-42)和Anle138b之间有交互性作用(F_(交互)=18.425、21.904,P<0.01)。单独效应分析显示,用oAβ_(1-42)处理时,Anle138b的处理效应明显(F=16.483、19.148,P<0.01);不用Anle138b处理时,oAβ_(1-42)的处理效应明显(F=14.149、38.209,P<0.01)。结论Anle138b可以减轻oAβ_(1-42)引起的海马神经元氧化应激和线粒体损伤,抑制oAβ_(1-42)对海马神经元的损伤。

神经复元方对卒中后抑郁大鼠海马神经元雄激素受体表达和活性的影响研究

[目的]观察神经复元方对卒中后抑郁(PSD)模型大鼠海马神经元雄激素受体(AR)的表达和活性的影响,为探讨其作用机制提供依据。[方法]采用经典线栓大脑中动脉加用慢性不可预见温和应激结合孤养法,建立PSD大鼠模型,随机分为假手术组、PSD模型组、神经复元方组、氟西汀组。采用糖水偏好实验、旷场实验及Morris水迷宫分时观察大鼠行为学变化,并在药物干预14 d后,采集大鼠海马组织得到神经元细胞,用免疫荧光法和蛋白质免疫印迹法检测细胞中磷酸化AR和非磷酸化AR(p-AR)表达。[结果]应激第14天,模型组、氟西汀组及神经复元方组糖水消耗量、旷场实验水平与垂直得分较手术前明显降低,模型建立成功。药物干预14 d后,氟西汀组、神经复元方组糖水消耗量、大鼠水平与垂直得分较应激第14天时明显增多,且明显高于模型组;与模型组比较,两组大鼠在Morris水迷宫中定位航行潜伏期缩短,空间搜索时在目标象限的持续时间延长、跨平台次数明显增多;检测细胞中的AR、p-AR阳性表达数与蛋白表达水平,较模型组显著提高。[结论]神经复元方可改善PSD模型大鼠抑郁症状,提升大鼠的学习记忆能力,其作用机制可能与促进海马神经元AR活化有关。

一种低密度及高纯度胎鼠原代海马神经元培养方法的优化及鉴定

目的通过将海马、皮层细胞共培养的方式建立一种低密度、高纯度、高稳定性的大鼠胎鼠原代海马神经元体外培养方法,以获取纯度更高、活力更好的原代海马神经元。方法分离孕16~18 d SD大鼠胎鼠的海马和皮层并分别剪碎,经0.125%胰蛋白酶消化后用200目细胞筛过滤,将获得的细胞悬液以包围的形式分别接种于培养板的内层和外环上,于含10%马血清的DMEM/F12培养基中进行共同培养,4~6 h细胞贴壁后更换培养基为维持培养基培养(Neurobasal培养基+2%B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺)。通过CCK-8试剂盒检测细胞活力,利用免疫荧光染色检测海马神经元纯度。结果海马神经元在5 d后形成纵横交错的神经网络,生长状态较好,经鉴定海马神经元的纯度高达98%,且能够稳定存活3周。结论利用海马、皮层细胞共培养的方法可以获取高纯度、高活性、高存活率、高稳定性的胎鼠原代海马神经元,可为神经系统中海马神经元相关疾病研究提供一定的实验条件。

一种改进的适用于膜片钳记录的成年大鼠海马神经元急性分离法(英文)

本文建立了一种快速、可靠的急性分离成年大鼠海马神经细胞的方法。此法可将实验大鼠的年龄提高到500 d以上,体重300 g以上;不损伤神经细胞膜的电学特性;形态上有差异的细胞易于分辨。用膜片钳技术的单通道和全细胞模式证实,在本实验条件下,约95％左右的健康细胞均能形成高阻抗封接,并成功地记录了电压依赖性钾、钠、钙通道,外向整流氯通道和大电导的钙激活钾通道电流。

抑郁症大鼠海马和顶叶皮质神经元NGF含量及其mRNA的表达

目的 :观察实验性抑郁症大鼠脑内神经生长因子含量及其 m RNA表达的变化。 方法 :采用长期不可预见性中等强度应激造成大鼠抑郁症模型。运用 openfield法观察大鼠行为学变化 ,运用免疫组化和原位杂交法观察神经元 NGF含量及其m RNA表达的变化。 结果 :与对照组相比 ,抑郁组大鼠海马和顶叶皮质神经元 NGF免疫阳性颗粒数目减少 ,着色浅淡 ;NGFm RNA杂交阳性信号减少。 结论 :实验性抑郁症大鼠海马和顶叶皮质神经元 NGF含量下降 ,NGF m RNA表达水平降低。

大鼠海马神经元neurobasal无血清的原代培养方法

目的：建立纯度和活力较高的无血清原代培养海马神经元的方法。方法：新生SD大鼠海马，用neurobasal培养基培养，免疫荧光鉴定神经元纯度，MTT法检测其活力。结果：神经元接种12～24h后贴壁，并长出细小突起，3d具有典型神经元形态特征，4d突起形成稀疏的神经纤维网络，8d后神经元5～10个聚集成团，突起密集，生长稳定，12d后出现细胞碎片。Tubulin荧光染色显示清晰的神经元，突起绵长且相互交织，占细胞总数的66．7％；GFAP荧光染色的细胞数量少，突起短粗，占33．7％。培养1～5d MTT代谢率逐渐上升，6～11d处于平台期，11d后下降。结论：neurobasal无血清培养获得的神经元纯度大于60％，6～11d的细胞适于细胞学实验。

改良的胎鼠海马神经元原代培养及模拟糖尿病并发抑郁环境对其的损伤作用

目的:建立一种改良的胎鼠海马神经元原代培养方法,研究模拟糖尿病并发抑郁(diabetes mellitus with depression,DD)环境对其的损伤作用。方法:取胎龄18 d的SD大鼠,体视显微镜下分离海马,0.25%胰蛋白酶和0.2%胶原酶(1∶1)消化后进行体外培养,分别观察培养后4 h、24 h、5 d、8 d、14 d海马神经元的基本形态结构;神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。采用高糖联合皮质酮造模构建类似糖尿病并发抑郁症状的模拟DD环境,MTT法检测神经元的存活率;流式AnnexinV/PI双染和Hoechst荧光染色检测神经元的凋亡情况。结果:经NSE免疫细胞化学鉴定,培养7 d后的神经元纯度达95%以上,细胞胞体成球形,树突分支明显,并相互交织成丰富的神经网络;高糖、皮质酮及两者联用造模18 h后,与正常对照组相比,MTT检测细胞存活率分别为53.1%、64.3%和56.7%,P<0.05;流式细胞仪检测正常对照组、高糖组、皮质酮组、两者联用组Q3区的比例(分别为71.6%、47.9%、53.6%和39.2%),明显低于阴性对照组(98.5%),P<0.05。后四者Q2+Q4区总比例分别为24.4%、46.6%、40.4%、67.0%;Hoechst染色结果提示上述三个造模组的神经元细胞核均出现不同程度的核染色质聚集、浓缩,甚至核碎裂,呈现出典型的凋亡特征。结论:成功建立一种操作简便、细胞纯度佳、活性好、产率高的胎鼠海马神经元原代培养方法,验证了模拟DD环境对海马神经元的损伤作用,为体外深入研究DD的发病机制及药物防治提供了实验依据。

新生大鼠海马神经元原代培养及膜片钳全细胞记录

目的探讨一种适用于膜片钳全细胞记录的海马神经元培养方法。方法选择鼠龄在1d内的Wistar大鼠,迅速断头,取双侧海马,神经基础培养基添加B-27及L-谷氨酰胺进行神经元原代培养,培养至第10天时,使用免疫荧光技术配合神经元特异性核蛋白NeuN进行细胞鉴定;神经元的电生理特征由膜片钳全细胞记录。结果该方法所培养神经元状态良好,经鉴定发现纯度可高达100%,通过膜片钳全细胞法可记录到自发性动作电位及自发性兴奋性突触后电流。结论本方法操作简便、高效,所培养的海马神经元状态良好,适用于膜片钳全细胞记录。

新生大鼠海马神经元原代无血清培养与鉴定

目的建立一种简单、易行的海马神经元无血清体外培养方法以获得高纯度、高活力的海马神经元。方法取新生24 h内SD大鼠,分离海马,经消化后种植于包被有Matrigel基膜的玻片上,24 h后换含有N2、B27的Neuro-basal无血清培养基,于不同时间在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态;采用β-tublinⅢ免疫荧光细胞化学技术鉴定海马神经元纯度。结果大部分海马神经元于3～24 h贴壁且可长出细长突起,3 d细胞具有典型神经元的形态特征,5d后神经元突起进一步增多并形成稠密的网络连接,7 d后神经元胞体丰满,趋于成熟。经β-tublinШ免疫荧光技术鉴定纯度为94.2%±3.6%。结论此方法简单有效,可获得高纯度的海马神经元。

卵巢移植对去势大鼠海马神经元形态及BDNF表达的影响

目的:观察卵巢移植后大鼠海马神经元形态变化及BDNF的表达,评价卵巢移植对海马神经元的保护效果。方法:制作去势SD大鼠模型,卵巢移植干预组在其肾被膜下移植出生3 d内的SD乳鼠卵巢,外源性激素干预组隔天给予腹腔注射乙烯雌酚1 mg/kg。分别于干预后的4、7、14和28 d,电镜观察海马神经元形态及免疫组化观察BDNF的表达情况。结果:卵巢移植后随着移植时间的延长血清雌激素和孕酮水平都逐步升高,乙烯雌酚组仅雌激素水平升高;各组海马神经元形态逐渐好转,移植14 d和28 d组海马神经元的形态改善优于同期给药组。卵巢移植组和乙烯雌酚组BDNF的表达在各区均有所升高,卵巢移植14 d和28 d组CA3区尤为明显(P<0.05)。结论:卵巢移植可以恢复卵巢内分泌功能,对海马神经元形态有改善作用及促进BDNF的表达,其神经元保护作用优于单纯乙烯雌酚干预组。

甘草酸对癫痫大鼠海马神经元损伤的保护作用及其机制

目的探讨甘草酸对癫痫大鼠海马神经元损伤的保护作用及相关机制。方法采用氯化锂-匹鲁卡品点燃制作大鼠癫痫模型,造模成功后大鼠随机分为癫痫组及甘草酸组,另外将不做任何处理的大鼠作为正常对照组,每组12只。利用Nissl法和TUNEL法检测大鼠海马神经元损伤及凋亡情况;JC-1法检测大鼠海马神经元线粒体膜电位;比色法检测天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase 3)和caspase 9的活性;Western blot法检测大鼠海马组织中cleaved-caspase 3、9,B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),细胞色素C(CytC),凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)蛋白表达。结果与正常对照组相比,癫痫组神经元细胞数减少(P<0.01),TUNEL阳性细胞数增加(P<0.01),线粒体膜电位降低(P<0.01),caspase 3、9活性提高(P<0.01),Bcl-2及线粒体中CytC表达量下调(P<0.01),Bax及细胞质中CytC、Apaf-1表达量上调(P<0.01)。与癫痫组比较,甘草酸组神经元细胞数增加(P<0.01),TUNEL阳性细胞数减少(P<0.01),线粒体膜电位提高(P<0.01),caspase 3、9活性降低(P<0.01),Bcl-2及线粒体中CytC表达量上调(P<0.01),Bax及细胞质中CytC、Apaf-1表达量下调(P<0.01)。结论通过阻断线粒体途径,甘草酸能够抑制癫痫大鼠的海马神经元损伤。

阿糖胞苷对大鼠海马神经元原代培养的影响

目的:探讨在大鼠海马神经元原代培养过程中,阿糖胞苷对培养神经元的影响。方法:将新生24 h大鼠,分离出海马组织,进行原代海马神经元培养,再将细胞分为阿糖胞苷组和对照组,阿糖胞苷组加入1μmol/L阿糖胞苷,通过检测神经元特异性标志物微管相关蛋白-2(Map-2)计算培养神经元的数量,通过台盼蓝染色法观察细胞的存活率。结果:培养第7天,阿糖胞苷组神经元数量为(11±3)个,对照组为(10±4)个,两组无明显差异;阿糖胞苷组神经元细胞在培养第14天时存活率为74%,培养第21天时存活率为49%,而对照组神经元14天时存活率为96%,21天存活率为88%,两组神经元存活率差异明显。结论:原代培养海马神经元时,阿糖胞苷对神经元产量及形态影响不明显,但是由于阿糖胞苷的毒性作用,明显缩短神经元的存活时间,影响长期培养神经元的存活率。

氯通道阻断剂对NO诱导离体大鼠海马神经元凋亡的保护作用

目的观察氯通道阻断剂SITS和DIDS对NO诱导的大鼠离体海马神经元凋亡的保护作用。方法离体培养12d的SD大鼠海马神经元,随机分为正常对照组、NO处理组、NO处理后使用氯通道阻断剂组,对各组神经元分别在相应的时间点进行Hoechst荧光染色观察凋亡细胞数和MTT实验定量检测神经元的存活率,Western blot分析凋亡信号分子Caspase-3的变化。结果SITS和DIDS呈剂量依赖性地抑制NO诱导的神经元损伤,并能抑制损伤所引起的Caspase-3的激活,提高神经元的存活率。结论氯通道阻断剂对NO诱导的大鼠海马神经元凋亡有一定的保护作用。

吗啡对大鼠海马神经元突触传递的作用及机制(英文)

目的:从离子通道角度研究吗啡对中枢神经系统兴奋性及抑制性突触传递的作用,以探讨吗啡镇痛机制。方法:原代培养新生Wistar大鼠的海马神经元。采用膜片钳技术研究吗啡对其兴奋性及抑制性突触后电流及谷氨酸诱发电流的影响。结果:①吗啡可明显增强海马神经元兴奋性突触传递,加吗啡后自发兴奋性突触后电流发放频率增加了207.8%(t=42.1828,P<0.01)。此作用可被阿片受体阻断剂纳洛酮阻断;②吗啡对微小兴奋性突触后电流的发放频率及谷氨酸诱发电流的幅度没有明显影响(t=0.962,t=0.791,P>0.05);③吗啡可明显抑制神经元自发抑制性突触后电流,纳洛酮可拮抗吗啡作用(P<0.01)。结论:吗啡对海马神经元的兴奋作用不是由于吗啡直接作用于兴奋性氨基酸—谷氨酸突触传递过程,而是可能由于抑制了抑制性中间神经元,间接产生的兴奋达到镇痛作用。

运用新的体视学方法定量研究大鼠海马结构神经元和突触数目

目的建立定量研究海马结构神经元数目和突触数目的无偏体视学方法。方法选择18月龄正常雌性Long-Evans大鼠5只,取一侧大脑半球进行石蜡包埋后切取14μm厚的冠状连续切片。根据均匀系统随机抽样的原则,在包含海马结构的连续切片中均匀随机地抽取切片。将抽取的一组切片进行神经元的组织化学染色,以计数神经元的数目;将抽取的另外一组切片进行突触的免疫组织化学染色,以计数突触的数目。在体视学设备下,计数大鼠海马结构CA1和DG的神经元数目和大鼠海马结构CA1、CA1放射层(CA1sr)、齿状回内分子层(DGiml)和齿状回外分子层(DGoml)的突触数目。结果得到大鼠海马结构CA1和DG的神经元数目分别为[(3.17×105)±(2.23×104)]和[(1.70×106)±(1.87×105)]。大鼠海马结构CA1、CA1 CA1 sr、DGiml和DGoml的突触数目分别为[(1.04×108)±(5.39×106)]、[(4.36×107)±(3.78×106)]、[(1.87×107)±(1.81×106)]和[(4.48×107)±(7.29×105)]。结论 本研究建立了定量研究海马结构各区域内神经元数目和突触数目的方法,可为定量研究正常老年及各种神经系统退行性疾病状态下海马结构各区域内神经元数目、突触数目及神经元与突触数目关系的改变提供方法学依据。

大鼠全脑缺血后海马CA1区锥体神经元L型钙通道电流的改变(英文)

已有研究表明在脑缺血期间及再灌流后早期,海马CA1锥体神经元细胞内钙浓度明显升高,这一钙超载被认为是缺血性脑损伤的重要机制之一.电压依赖性钙通道是介导正常CA1神经元钙内流的主要途径.实验观察了脑缺血再灌流后早期海马CA1锥体神经元电压依赖性L型钙通道的变化.以改良的四血管闭塞法制作大鼠 15min前脑缺血模型,在急性分离的海马CA1神经元上,采用膜片钳细胞贴附式记录L型电压依赖性钙通道电流.脑缺血后CA1神经元L型钙通道的总体平均电流明显增大,这是由于通道的开放概率增加所致.进一步分析单通道动力学显示,脑缺血后通道的开放时间变长,通道的开放频率增大.

低氧预适应可减少缺氧—复氧后大鼠海马培养神经元凋亡

用原位末端标记 ( TUNEL )法观察低氧预适应对大鼠海马培养神经元缺氧 -复氧后神经元凋亡的影响。结果显示 ,经低氧预适应的海马神经元缺氧 -复氧后凋亡神经元百分率明显低于对照组。本结果表明 ,低氧预适应可使体外培养的海马神经元对缺氧产生耐受 ,减少缺氧

新生大鼠海马神经元的体外原代培养

目的 研究体外原代培养新生大鼠海马神经元的方法，并观察其发育分化过程中形态学的变化。方法 取出生24h内的Wistar大鼠分离海马，消化后差速贴壁，种植在涂有多聚-L-赖氨酸的盖玻片上，于不同时间在倒置相差显微镜下观察形态变化；采用NSE免疫细胞化学技术鉴定神经元。结果 神经元12～24h后大部分贴壁，随时间延长形态多变，突起逐渐增多，神经元突起间互相接触形成网络。培养第7～10天时细胞最为丰满，至28天时培养液中有悬浮的细胞碎片。NSE鉴定结果显示神经元纯度为（92．3±6．8）％。结论 该方法简单易行，神经元纯度较高，可作为神经元体外培养的良好模型用于以后的研究。

噪声对大鼠学习记忆中海马区NOS阳性神经元表达的影响

目的 :拟在白噪声下观察对大鼠学习记忆的影响及海马区NOS的变化 ,探讨噪声所致大鼠学习记忆下降的机制。方法 :44只SD大鼠 ,其中 2 0只随机分两组 ,分别在持续 80dB (A)白噪声和无噪声的环境下 ,在Y -迷宫中进行空间辨别学习记忆训练 ,了解噪声对大鼠学习记忆的影响 ,另 2 4只大鼠随机分三组 :噪声训练组、正常训练组和噪声观察组 ,以同样的方法训练 ,用免疫组化的方法观察持续噪声对海马区NOS阳性神经元表达变化。结果 :噪声能降低大鼠学习记忆能力 ,而且海马区NOS阳性神经元较正常对照组的数量及染色强度显著降低。结论 :噪声降低海马区神经元活性 ,NOS的合成减少 ,抑制海马习得性长时程突触增强 ,影响记忆的获得与保持 。