Ca^(2+)/calpain信号调控纤连蛋白诱导的MCF-10A乳腺上皮细胞-间质转化的作用

目的:观察Ca^(2+)/calpain信号通路在纤连蛋白(FN)诱导MCF-10A乳腺上皮细胞-间质转化(EMT)中的作用。方法:以正常培养MCF-10A乳腺上皮细胞为实验对象。采用比色法检测细胞内Ca^(2+)浓度;采用荧光分光光度法检测钙蛋白酶-2(calpain-2)活性;Western blot法检测calpain-2、波形蛋白(vimentin)、E-钙黏着蛋白(E-cadherin)的表达;采用划痕修复实验检测细胞迁移能力;Transwell小室实验检测细胞侵袭能力。结果:FN诱导MCF-10A细胞中Ca^(2+)浓度、calpain-2活性表达明显升高,上调vimentin、calpain-2蛋白表达,下调E-cadherin蛋白水平;FN诱导MCF-10A细胞迁移和侵袭能力显著增强。钙离子螯合剂(BAPTA-AM)和氨氯地平(amlodipine)均能显著抑制FN诱导的细胞Ca^(2+)浓度、calpain-2活性及表达升高;抑制vimentin蛋白表达上调及E-cadherin蛋白表达下调;抑制FN诱导MCF-10A细胞迁移和侵袭能力增强。结论:BAPTA-AM和Amlodipine均能够抑制FN诱导的上皮间质转化。FN能够诱导MCF-10A乳腺上皮细胞发生EMT,可能与Ca^(2+)/calpain信号通路激活有关。

乳移平对乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭和上皮间质转化的抑制机制研究

目的:研究中药复方乳移平对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和细胞周期的影响。方法:采用药物浓度递增法培养MCF-7细胞,随机分为空白对照组、乳移平组。CCK-8法检测细胞增殖水平,平板克隆形成实验检测细胞克隆能力,细胞迁移实验检测细胞水平迁移能力,流式细胞术检测不同药物对细胞周期及凋亡的影响,Western Blot检测蛋白水平的表达,明胶酶谱测定MCF-7细胞中MMP-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的活性。结果:CCK-8法显示,与空白对照组相比,乳移平组可抑制细胞增殖(P<0.0001)。平板克隆结果显示,与空白对照组相比,乳移平给药组细胞克隆率显著降低(P<0.0001)。划痕实验结果表明,乳移平给药组MCF-7细胞进入空腔的能力明显低于空白对照组(P<0.05)。侵袭实验表明,乳移平给药组同空白对照组相比,MCF-7细胞的侵袭细胞数明显减少(P<0.05)。流式细胞术结果显示,与空白对照组相比,乳移平给药组G2期细胞数量相对较少(P<0.05)。Western Blot结果表明,同阴性空白对照组相比,乳移平下调N-钙黏蛋白、Vimentin、Snail1和Snail2的表达,而上调E-钙黏蛋白的表达(P<0.05)。结论:乳移平对MCF-7乳细胞生长和侵袭的抑制作用,其机制可能是通过诱导细胞周期阻滞、减少MMP9的活性和抑制上皮-间质转化(EMT)。

钙蛋白酶抑制剂对纤连蛋白诱导的MCF-10A乳腺上皮细胞-间质转化的影响

本研究观察钙蛋白酶抑制剂(ALLN和calpain inhibitorⅣ)对纤连蛋白(FN)诱导的MCF-10A乳腺上皮细胞-间质转化(EMT)的影响。FN作用MCF-10A细胞48 h后,采用划痕修复实验检测MCF-10A细胞的迁移能力;基质胶包被的transwell小室实验检测细胞的侵袭能力;Western blot法检测波形蛋白(vimentin)、E-钙粘着蛋白(E-cadherin)、锌指蛋白(snail)和钙蛋白酶-2(calpain-2)的表达。研究结果显示,FN诱导MCF-10A细胞形态发生改变;显著增加MCF-10A细胞的迁移和侵袭能力;上调calpain-2、vimentin和snail蛋白表达,下调E-cadherin蛋白水平。ALLN和calpain inhibitorⅣ能显著抑制FN诱导的MCF-10A细胞形态变化、迁移和侵袭能力增强、vimentin、snail和calpain-2蛋白表达上调及E-cadherin蛋白表达下调。以上研究结果表明,FN诱导MCF-10A乳腺上皮细胞发生EMT可能与上调calpain-2的表达有关,ALLN和calpain inhibitorⅣ能够抑制FN诱导的上皮间质转化。

情志应激激素受体调控Yes相关蛋白1影响乳腺癌细胞上皮间充质转化进程研究

目的:探究情志应激激素受体(GR)与Yes相关蛋白1(YAP1)对乳腺癌MCF-7细胞转移的调控机制,以期为乳腺癌的治疗提供新思路。方法:通过免疫组化实验分析乳腺癌组织和癌旁组织GR和YAP1的表达;将MCF-7细胞分为:si NC组、si GR组和si YAP1组,分别通过MTT实验、Transwell实验、细胞划痕实验和流式细胞术分析MCF-7细胞的增殖、侵袭、迁移能力及凋亡率,通过蛋白免疫印迹实验分析细胞GR和YAP1的表达水平。结果:与癌旁正常组织比较,乳腺癌组织YAP1与GR的表达水平升高。与si NC组比较,si GR组和si YAP1组的MCF-7细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力显著降低,凋亡率增加(P<0.05)。与si NC组比较,si GR组的MCF-7细胞的YAP1和GR表达水平降低(P<0.05),si YAP1组的MCF-7细胞的YAP1表达水平降低(P<0.05)。结论:乳腺癌患者的癌组织中YAP1与GR的表达水平升高。GR被激活后,通过调控细胞内的YAP1通路影响MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力以及凋亡率,进而导致乳腺癌MCF-7细胞转移,靶向调节YAP1抑制乳腺癌上皮间充质转化(EMT)发生可为乳腺癌患者提供新的治疗策略。

消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞PI3K/Akt通路的影响及机制

目的探讨消痰解郁方对乳腺癌前病变MCF-10AT细胞PI3K/Akt信号通路的影响及机制。方法将MCF-10AT细胞分为消痰解郁方组、PI3K激酶选择性抑制剂LY294002组(抑制剂组)、消痰解郁方+抑制剂组和对照组。给予相应药物干预24、48h后,采用CCK-8法观察各组细胞增殖及生长情况;药物干预48h后,采用流式细胞仪检测各组细胞周期变化,用蛋白质印迹法检测各组细胞PTEN、PI3K、Akt蛋白表达变化。结果药物干预24和48h后,消痰解郁方组、抑制剂组和消痰解郁方+抑制剂组MCF-10AT细胞增殖受到抑制,且消痰解郁方+抑制剂组抑制率高于消痰解郁方组和抑制剂组,差异有统计学意义(P<0.05);药物干预48h后,消痰解郁方组、抑制剂组和消痰解郁方+抑制剂组MCF-10AT细胞G0/G1期细胞比例增高,S期及G2/M期细胞比例下降,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),其中消痰解郁方+抑制剂组与其他各组相比差异有统计学意义(P<0.05);药物干预48h后,消痰解郁方组、抑制剂组、消痰解郁方+抑制剂组PI3K、p-Akt蛋白表达较对照组减弱,PTEN蛋白表达较对照组增强,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论消痰解郁方可能通过抑制PI3K/AKT信号通路发挥其对MCF-10AT细胞的抑制及促凋亡作用。

基于Calpain-ERK信号通路研究Calpeptin对雌激素诱导人乳腺上皮细胞MCF-10A转化及干性标志物表达的影响

目的:研究钙激活中性蛋白酶(Calpain)抑制剂Calpeptin对雌二醇(E2)诱导人乳腺上皮细胞MCF-10A转化及干性标志物表达的影响,并探讨其作用机制。方法:以人乳腺上皮细胞MCF-10A为研究对象,采用E2诱导制备转化细胞模型。将细胞分为对照组[0.1%二甲基亚砜(DMSO)]、E2转化组(50 nmol/L)、E2转化+Calpeptin组(50 nmol/L E2+1μmol/L Calpeptin),以相应含药培养基连续培养15代。然后采用MTT法检测细胞的增殖率(24、48 h),采用平板克隆试验检测细胞的克隆形成率,采用悬浮成球试验检测细胞的成球数;采用实时荧光定量-聚合酶链式反应法检测细胞中干性标志物(CD44、Nanog、OCT4)和细胞外信号调节激酶(ERK)m RNA表达水平,并采用Western blotting法检测细胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK和磷酸化ERK(p-ERK)蛋白表达水平。另取E2转化细胞分为对照组(0.1%DMSO)和U0126(ERK抑制剂)组(10μmol/L),按上述方法测定细胞的克隆形成率、成球数以及细胞中CD44、Nanog、OCT4、p-ERK蛋白表达水平,以验证ERK表达抑制与转化细胞生物学行为及干性标志物表达之间的关系。结果:与对照组比较,E2转化组细胞的增殖率(24、48 h)、克隆形成率均显著升高(P<0.01),细胞成球数均显著增加(P<0.01),细胞中CD44、Nanog、OCT4、p-ERK m RNA表达水平及CD44、Nanog、OCT4、p-ERK蛋白表达水平均显著升高(P<0.01)。与E2转化组比较,E2转化+Calpeptin组细胞的增殖率(24、48 h)、克隆形成率均显著降低(P<0.01),细胞成球数显著减少(P<0.05),细胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK mRNA表达水平及CD44、Nanog、OCT4、p-ERK蛋白表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01)。加入ERK抑制剂U0126后,E2转化细胞的克隆形成率、成球数以及细胞中p-ERK、CD44、Nanog、OCT4蛋白表达水平均显著增加或升高(P<0.05或P<0.01)。结论:Calpeptin可抑制E2诱导的人乳腺上皮细胞MCF-10A转化及干性标志物表达,其机制可能与抑制Calpain-ERK信号通路的激活有关。

miRNA-186调控CDK6和IL-10表达抑制乳腺癌MCF-7细胞生长与转移机制的研究

目的探讨miR-186介导的CDK6和IL-10表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡及侵袭的影响。方法用已构建的miR-186 mimic质粒转染乳腺癌MCF-7细胞,荧光显微镜下观察转染效率,Western blot技术检测重组质粒对CDK6和IL-10表达的影响,光学显微镜下观察细胞生长群落,分别用MTT法、流式细胞术和Transwell小室法测定重组质粒转染对细胞增殖、凋亡周期及侵袭能力的影响。结果 miR-186转染效率良好,与non-targeting组比较,在转染miR-186后,可明显抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖(P<0.01),细胞生长群落分析结果显示,miR-186组细胞群落数目明显低于non-targeting组细胞(P<0.01),细胞周期结果显示,miR-186组的G0/G1和S期百分比明显的低于non-targeting组(P<0.05),G2/M期百分比明显的高于non-targeting组(P<0.05),Transwell检测结果显示,miR-186组乳腺癌MCF-7细胞侵袭细胞数量(81.00±2.00)个明显少于non-targeting组(125.00±3.00)个,miR-186转染后,CDK6和IL-10在miR-186组乳腺癌MCF-7细胞中的表达率明显低于non-targeting组。结论 miR-186可下调乳腺癌MCF-7细胞中CDK6和IL-10的表达,可有效抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖、侵袭,miR-186可能成为一个潜在的乳腺癌基因治疗靶标。

JNK/MAPK在LPS诱导乳腺癌细胞MCF-7上皮间质转化过程中的作用

目的:探讨JNK/MAPK在LPS诱导乳腺癌细胞上皮间质转化(EMT)过程中的作用。方法:将乳腺癌细胞MCF-7分为3组:正常对照组、LPS(10μg/ml)处理组、LPS+SP-600125诱导实验组。应用realtime RT-PCR与Western blot法检测上皮细胞表面标志E-钙黏蛋白(E-cadherin)和间质细胞表面标志N-钙黏蛋白(N-cadherin)的表达以及C-Jun氨基末端激酶(JNK)表达。结果:LPS促进乳腺癌细胞系MCF-7的上皮间质转化(EMT)发生。MCF-7细胞的EMT过程伴随JNK1/2活性增加。应用SP-600125(10μmol/L)阻断JNK后,MCF-7细胞的EMT消失。结论:JNK在LPS诱导乳腺癌细胞MCF-7上皮间质转化过程中发挥调控作用。

瘦素激活PI3K/Akt信号通路分泌白介素8促进乳腺癌MCF-7细胞上皮间质转化

目的探讨瘦素(Leptin)对人乳腺癌MCF-7细胞上皮间质转化(EMT)过程的影响,并探讨其机制。方法免疫荧光法检测MCF-7细胞Leptin受体(Ob-R)的表达;前期实验分为PBS组和Leptin组,显微镜检查Leptin对MCF-7细胞形态的影响;Western blot法检测Leptin对MCF-7细胞EMT相关蛋白分子表达的影响;Western blot法检测Leptin对MCF-7细胞关键分子IL-8及下游信号通路分子p-Akt表达的影响。为探讨关键分子IL-8在Leptin所介导的MCF-7细胞EMT过程中的作用,后续实验分为PBS组、Leptin组、Leptin+anti-IL-8组、Leptin+IgG组,应用免疫荧光法检测IL-8封闭后Leptin对MCF-7细胞EMT相关蛋白分子表达的影响。结果免疫荧光检测到MCF-7细胞中有Leptin受体(Ob-R)的表达;经Leptin刺激后,MCF-7细胞上皮标志分子E-cadherin蛋白相对表达量为0.14±0.04,较PBS组的0.84±0.06显著下降,间质标志分子Vimentin蛋白表达量为1.04±0.14,较PBS组的0.12±0.02显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05),同时MCF-7细胞镜下形态发生上皮间质转化;Leptin作用MCF-7细胞后,肿瘤相关炎症因子IL-8蛋白相对表达量为0.90±0.07,较PBS组的0.14±0.03显著升高,促肿瘤相关信号通路分子p-Akt蛋白相对表达量为0.81±0.07,较PBS组的0.11±0.03显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05),而总Akt蛋白相对表达量为0.91±0.04,与PBS组的0.89±0.07比较差异无统计学意义(P>0.05);免疫荧光检测结果显示,相对于Leptin+IgG组,Leptin+anti-IL-8组上皮相关分子E-cadherin相对荧光表达量由29.73±1.51降低为6.29±0.54,间质相关分子Vimentin相对荧光表达量由3.90±0.39升高为23.38±0.81,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论Leptin可能通过激活PI3K/Akt信号通路分泌IL-8进而促进乳腺癌MCF-7细胞EMT过程。

盐霉素对乳腺癌MCF-7球囊细胞增殖与上皮间质转化作用的研究

目的探讨盐霉素(Salinomycin)对MCF-7球囊(MCF-7 MS)细胞的增殖与上皮间充质转化(EMT)的作用。方法通过乳腺癌MCF-7细胞无血清悬浮培养富集乳腺癌干细胞(BCSCs)得到MCF-7 MS;CCK-8 assay检测0、10、30、100、300、1 000、3 000及10 000 nmol/L浓度的盐霉素处理24 h对MCF-7 MS细胞存活率的影响,并计算半抑制浓度(IC50)值。Western blot检测30、60 nmol/L终浓度的盐霉素对MCF-7 MS细胞上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)和间质化标志物Snail表达的影响,以等体积DMSO处理的MCF-7 MS细胞作为对照组。BALB/c裸鼠皮下接种MCF-7 MS细胞制备荷瘤鼠模型并分为对照组(等体积生理盐水处理)和盐霉素给药组(5 mg/kg盐霉素处理),免疫组织化学染色检测瘤组织E-cadherin和Snail的表达。结果随着浓度的增加,MCF-7 MS细胞存活率逐渐下降(P<0.05),24 h的IC50值为989 nmol/L。与对照组比较,30和60 nmol/L的盐霉素均可增加E-cadherin的表达,而降低Snail的表达,且后者作用更明显(P<0.05)。与对照组相比,盐霉素给药组荷瘤鼠瘤组织内E-cadherin的表达升高,而Snail的表达下调(P<0.01)。结论盐霉素能够抑制具有BCSCs特性的MCF-7 MS细胞的增殖,且可抑制MCF-7 MS细胞的EMT,是靶向肿瘤干细胞的潜在药物。

沉默FOXC2对TGF-β_1诱导的MCF-7细胞上皮-间质转化的逆转作用

目的:探讨沉默叉头框C2(FOXC2)表达对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人乳腺癌MCF-7细胞上皮-间质转化(EMT)的逆转作用和对乳腺癌侵袭性的影响。方法:将体外培养的MCF-7细胞用5μg/L TGF-β1处理,相差显微镜观察细胞形态学变化;免疫荧光检测EMT相关标志物表达。慢病毒介导的FOXC2-siRNA载体转染至TGF-β1诱导成功的MCF-7细胞,以RT-PCR和Western blotting方法检测FOXC2及EMT相关标志物上皮性钙黏蛋白(E-cad)、紧密连接蛋白1(CLDN1)、纤维连接蛋白1(FN1)mRNA及蛋白表达;Transwell小室模型检测沉默FOXC2表达对TGF-β1诱导的MCF-7细胞侵袭性的影响。结果:TGF-β1可诱导MCF-7细胞向间质样细胞表型转换,并上调间质样标志物FN1表达和下调上皮样标志物E-cad及CLDN1表达;而沉默FOXC2表达可逆转已间质化的MCF-7细胞恢复至上皮表型,并降低其侵袭性。结论:TGF-β1可诱导人乳腺癌MCF-7细胞发生EMT并增加其侵袭性,且TGF-β1这种诱导作用能被FOXC2-siRNA所逆转,并降低细胞的侵袭能力。

圣草酚通过miR-128-3p/MAPK轴对乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响

目的圣草酚是一种重要的类黄酮,普遍存在于植物界,但少有对圣草酚的抗癌活性的报道。该研究旨在探究其对人乳腺癌(breast cancer,BC)的抗癌潜力及可能的机制。方法体外培养人乳腺癌细胞MCF-7和人乳腺上皮细胞FR2,通过MTT法检测圣草酚诱导的初始细胞毒性。再次培养MCF-7细胞,MTT法和集落形成实验评估圣草酚对MCF-7细胞增殖的影响;流式细胞术评估圣草酚对MCF-7细胞凋亡和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)的作用;RT-qPCR和Western Blot法检测miR-128-3p和MAPK相关基因(p38 MAPK和HSP27)在圣草酚发挥抗癌功能中的作用。裸鼠体内异种移植模型中分析圣草酚对肿瘤生长的作用,TUNEL法检测圣草酚对细胞凋亡的影响。结果当圣草酚浓度超过12.5μmol·L^(-1)时,MCF-7细胞活力随着圣草酚浓度的增高而逐渐降低(P<0.05);圣草酚干预后,MCF-7细胞活力、集落形成数量和MMP均下调,细胞凋亡率增高(P<0.05);细胞中miR-128-3p水平增高,p38 MAPK和HSP27磷酸化水平均降低(P<0.05)。转染miR-128-3p抑制物在一定程度上可以逆转圣草酚对MCF-7细胞的影响(P<0.05);在转染miR-128-3p抑制物的基础上添加MAPK通路抑制剂可以削弱这种逆转作用(P<0.05)。此外,裸鼠体内异种移植模型实验证明了圣草酚可呈剂量依赖性降低裸鼠肿瘤组织生长,促进细胞凋亡(P<0.05)。结论圣草酚可有效抑制人乳腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡,这可能与其调控miR-128-3p/MAPK轴有关。

miR-1297通过下调TET3促进乳腺癌MCF-7细胞的恶性生物学行为

目的:探讨miR-1297对乳腺癌细胞恶性生物学行为的调控作用及其潜在机制。方法:选用2016年5月至2018年5月乐山市人民医院甲乳外科手术切除的20例乳腺癌组织和癌旁组织标本以及乳腺癌细胞系MCF-7、SW626、HCC1937和人乳腺上皮细胞MCF-10A,用q PCR检测乳腺癌组织和细胞系中miR-1297的表达水平。实验分为对照组、miR-1297 inhibitor组、TET甲基胞嘧啶双加氧酶3(TET3)过表达组及同时过表达TET3和miR-1297组,用CCK-8、Transwell实验检测MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力,用WB检测MCF-7细胞中TET3和EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin和vimentin)的表达水平。用双荧光素酶报告基因验证miR-1297与TET3的靶向关系。结果:miR-1297在乳腺癌组织和细胞系中均高表达(P<0.01或P<0.05)。敲降miR-1297后,MCF-7细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT均明显受到抑制(P<0.05或P<0.01)。转染pcDNA3.1-TET3后,MCF-7细胞TET3的表达水平显著上调(P<0.05);同时过表达TET3和miR-1297能够逆转MCF-7细胞中TET3的表达水平及TET3对MCF-7细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的抑制作用。双荧光素酶报告基因结果显示,miR-1297靶向结合TET3的3’UTR,miR-1297靶向下调TET3从而促进MCF-7细胞的恶性生物学行为。结论:miR-1297在乳腺癌组织和细胞中高表达,其通过靶向下调TET3的表达水平促进MCF-7细胞增殖、迁移、侵袭和EMT等恶性生物学行为。

复方仙蓉颗粒抑制MCF-10AT乳腺癌癌前病变的研究

目的:建立MCF-10AT乳腺癌癌前病变模型,探讨复方仙蓉颗粒(Compound Xian Rong Granules,CXRG)对MCF-10AT乳腺癌癌前病变模型的抑制作用。方法:采用体外接种MCF-10AT细胞于BALB/c雌性裸鼠,并肌注苯甲酸雌二醇建立乳腺癌癌前病变模型。随机分为模型组、CXRG组、三苯氧胺(Tamoxifen,TAM)组,每组20只。分接种后21、35、49、63天,分组观察裸鼠移植瘤重量及体积变化,观察移植瘤组织形态学变化。结果:接种后21天起裸鼠移植瘤组织均出现不同程度的增生。接种后35～49天,3组裸鼠移植瘤组织均出现不同程度的不典型增生,发生率为80%～100%。接种后63天,共出现3例浸润癌,其中模型组2/7,TAM组1/7;而CXRG组表现与49天时相似。结论:复方仙蓉颗粒能抑制或减缓MCF-10AT乳腺癌癌前病变的增殖,作用优于三苯氧胺。

miR-129-5p调节小鼠乳腺上皮细胞内Igf-1的表达

MicroRNAs(miRNAs)是一类大约22个核苷酸的非编码RNA.它能通过调控生长因子表达,引发肿瘤形成、细胞增殖和组织器官发育.本文通过构建miR-129-5p靶基因序列的双荧光素酶报告载体分析了miR-129-5p与靶基因之间的关系,应用脂质体转染技术和实时荧光定量技术观察了miR-129-5p在小鼠乳腺上皮细胞中的表达量及其变化,通过CASY细胞活力仪检测转染后的细胞增殖与活力变化,采用Western印迹方法检Igf-1的变化.结果表明:miR-129-5p在小鼠乳腺青春期表达最高,成功构建了Igf-1基因3'UTR荧光素酶报告载体,miR-129-5p抑制其荧光素酶活性(P<0.01),转染抑制子后miR-129-5p表达降低(P<0.01),胰岛素样生长因子(Igf-1)表达增强(P<0.05),细胞增殖和活力增强(P<0.01),结果提示:miR-129-5p可能通过抑制靶基因蛋白Igf-1的表达,进而抑制小鼠乳腺上皮细胞增殖和活力.

Twist基因逆转录病毒载体的构建及其诱导正常乳腺上皮细胞发生上皮间质转化

目的构建Twist基因逆转录病毒载体,研究其对人正常乳腺上皮细胞MCF10A的影响。方法酶切pcDNA3/mycTwist获得myc-Twist,克隆到逆转录病毒载体pBABE-puro中,构建重组质粒pBABE-myc-Twist。通过酶切、测序鉴定Twist基因正确后,在体外将质粒pBABE-myc-Twist和其对照分别与包装质粒pAmpho共同转染人胚肾上皮细胞系293T细胞,进行逆转录病毒的包装,并感染人正常乳腺MCF10A上皮细胞,用嘌呤霉素(puromycin)筛选,获得成功转入Twist的MCF10A-Twist细胞和MCF10A-Vector对照细胞。通过RT-PCR和Western blot法验证Twist细胞在MCF10A-Twist和MCF10A-Vector细胞内的表达。免疫荧光技术和Western blot法检测细胞内上皮间质转化(EMT)标志蛋白的表达。Transwell^(?)法检测细胞的迁移和侵袭能力。结果重组逆转录病毒载体质粒pBABE-myc-Twist经酶切和测序鉴定构建正确;Twist基因被逆转录病毒成功导入MCF10A细胞,并在靶细胞内稳定表达,RT-PCR检测到Twist mRNA在MCF10A-Twist细胞中表达,Western blot法检测发现myc-Twist蛋白在MCF10A-Twist细胞中表达;免疫荧光和Western blot法检测显示在MCF10A-Twist细胞中E-cadherin表达显著下调、vimentin表达明显上调;与MCF10A-Vector细胞相比,Transwell^(?)法检测发现MCF10A-Twist细胞迁移和侵袭能力明显增加(P<0.01)。结论 Twist诱导MCF10A细胞发生EMT转化,并促进其迁移和侵袭。

基于EMT的芒柄花素抑制人乳腺癌MCF-7细胞迁移、侵袭及其机制的研究

目的研究芒柄花素对人乳腺癌MCF-7细胞迁移、侵袭及相关信号通路的影响,为揭示芒柄花素抑制肿瘤转移机制提供依据。方法采用CCK-8法、细胞划痕实验、黏附实验、侵袭实验检测芒柄花素对MCF-7细胞增殖、迁移、黏附和侵袭能力的影响。采用Western blot检测芒柄花素对人上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(vimentin)、转化生长因子β(TGF-β)信号通路的TGF-β1、基质金属蛋白激酶2/9(MMP-2/9)及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的磷酸化细胞外调节激酶1/2(p-ERK1/2)、磷酸化p38蛋白(pp38)表达水平的影响。结果芒柄花素可显著抑制MCF-7细胞的增殖,降低迁移率、黏附率和侵袭率,上调E-cadherin蛋白表达,下调TGF-β1、vimentin、MMP-2/9、p-ERK1/2、p-p38蛋白表达。结论芒柄花素可抑制MCF-7细胞增殖、迁移、黏附和侵袭,其机制可能与调控EMT过程中E-cadherin和vimentin及TGF-β信号通路中TGF-β1、MMP-2/9和MAPK信号通路的p-ERK1/2、p-p38的表达有关。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1β对乳腺癌干细胞干性表达的调控

背景:研究表明,过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1β(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1beta,PGC-1β)通过PI3K/AKT/mTOR信号通路影响乳腺癌细胞的增殖、迁移及凋亡。而PGC-1β能否通过PI3K/AKT/mTOR信号通路影响乳腺癌干细胞的干性及其影响机制还不清楚。目的:探究PGC-1β对乳腺癌干细胞干性的影响及调控机制。方法:将PGC-1β空载体、过表达载体(Lv-PGC-1β)、干扰载体(Sh-PGC-1β)分别转染乳腺肿瘤MCF-7细胞,荧光显微镜观察转染效果;qRTPCR及Western blot验证慢病毒转染后PGC-1βmRNA和蛋白的相对表达。在干性培养基中分别培养未转染组、PGC-1β空载体组、PGC-1β过表达组及PGC-1β干扰组的MCF-7细胞使其成为乳腺癌干细胞,显微镜下观察并记录干细胞球体的形成过程,Western blot验证干性标志物(ABCG2、ALDH1、OCT4)、上皮-间充质转化标记物(E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Slug和ZEB1)及PI3K/AKT/mTOR通路核心蛋白的相对表达。结果与结论:①MCF-7贴壁细胞经干性培养基培养形成了折光性好、中间密度高的致密球干细胞;②乳腺癌干细胞干性蛋白的表达明显高于其贴壁细胞(P<0.01);③与未转染组、空载体组相比,PGC-1β过表达组乳腺癌干细胞的形成时间缩短,细胞球体数目增多、球体直径增大(P<0.01),而PGC-1β干扰组细胞球体数目减少、球体直径减小(P<0.01);④PGC-1β过表达组干性相关蛋白的表达高于未转染组、空载体组(P<0.01),上皮-间充质转化相关蛋白E-Cadherin表达低于未转染组、空载体组(P<0.01),而N-Cadherin、Vimentin、Slug和ZEB1的表达高于未转染组、空载体组(P<0.01);PI3K/AKT/mTOR相关蛋白及其磷酸化相关蛋白表达高于未转染组、空载体组(P<0.01),PGC-1β干扰组结果则与PGC-1β过表达组相反;⑤结果提示,PGC-1β能够通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路影响乳腺癌干细胞上皮-间充质转化,从而促进乳腺癌干细胞的形成及干性相关标志物的表达。

Tspan29在乳腺癌组织中的表达及其对MCF-7和MDA-MB-231细胞恶性生物学行为的影响

目的:检测4次穿膜蛋白29(tetraspanins-29,Tspan29)在乳腺癌组织和细胞系中的表达水平,探讨敲低Tspan29对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化(epithelieal-mesenchymal transition,EMT)的影响。方法:收集2017年6月至2018年2月复旦大学附属肿瘤医院闵行分院手术切除的20例乳腺癌患者的癌组织和相应的癌旁组织标本,以及乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231和人乳腺上皮细胞MDA-kb2,用qPCR和Western blotting检测乳腺癌组织和细胞系中Tspan29的表达水平。通过siTspan29对MCF-7、MDA-MB-231细胞中Tspan29进行干扰,用qPCR法检测转染细胞中Tspan29mRNA和蛋白的表达水平,PCR芯片法检测MCF-7细胞中EMT相关基因的表达,用CCK-8法、Transwell实验检测MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结果:乳腺癌组织中Tspan29 mRNA和蛋白的表达水平显著高于癌旁组织(均P<0.01),MCF-7和MDA-MB-231细胞中Tspan29 m RNA和蛋白的表达水平显著高于MDA-kb2细胞(均P<0.01)。siTspan29干扰后,MCF-7细胞中Tspan29 mRNA和蛋白的表达水平显著下降(均P<0.05);MCF-7细胞中EMT相关基因中有2个基因显著上调,有7个基因显著下调;MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖、迁移及侵袭能力显著下降(均P<0.05)。结论:Tspan29在乳腺癌组织及细胞系中表达水平显著上调,敲低Tspan29对乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭有显著的抑制作用。