不同物种Mchr1基因编码区生物信息学分析

采用比较基因组学和生物信息学的方法分析了人、黑猩猩、玻利维亚灰鼠猴、猕猴、蒙眼貂、裸鼢鼠、佛罗里达海牛、小家鼠、小马岛猬共9个物种的黑色素浓集激素受体1（Mchr1）基因编码区（CDS）的遗传多样性,并对其氨基酸序列、蛋白结构等进行预测.结果表明,来自9个物种的44个Mchr1基因序列中共检测到多态位点200个,其中单一多态位点81个,单倍型14种,Mchr1基因CDS在种内表现较为保守,种间则表现出较丰富的遗传多样性.Mchr1蛋白为疏水性蛋白,理论等电点均大于7,肽链的不稳定系数介于36.26～44.21,均较稳定.Mchr1蛋白位于细胞质中.

MCHR1拮抗剂抗肥胖症的研究进展

世界范围内广泛流行的肥胖症影响着11亿人口的生活,给患者和卫生健康事业带来沉重负担,由此许多制药公司前瞻性地研究抗肥胖药物。MCH系统显著调节人和鼠类的能量平衡和食物摄取,MCHR1拮抗剂成为抗肥胖症药物研究的热点。

人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建人MCHR1真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染的HEK293细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HEK293细胞系,用RT-PCR、Western-blot检测MCHR1的表达。结果构建了pcDNA3.1(+)/MCHR1真核表达载体,建立了稳定转染的HEK293细胞系,并成功地表达了目的基因。结论真核表达载体成功构建和稳定转染HEK293细胞系的建立为进一步研究MCHR1的功能奠定了良好的实验基础。

人MCHR1真核表达载体的构建

目的构建人MCHR1真核表达载体。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3．1(+),酶切和测序鉴定。结果酶切和测序鉴定正确,表明pcDNA3．1(+)/MCHR1真核表达载体构建成功。结论pcDNA3．1(+)/ MCHR1真核表达载体成功构建,为进一步研究MCHR1的功能提供了良好的实验基础。

以黑色素浓集荷尔蒙受体为靶点高通量筛选细胞模型的建立

背景:研究表明,激活黑色素浓集荷尔蒙(melanin concentrating hormone,MCH)受体可引起细胞内钙浓度的变化,通过检测钙浓度的变化可以反映受体的功能。目的:建立以MCHR为靶点的高通量筛选细胞模型。设计、时间及地点:对比观察,于2006-09/11在中国科学院北京基因组研究所药理组实验室完成。材料:人胎脑TotalRNA购自STRATAGENE公司,经中国科学院北京基因组研究所药理组反转录为cDNA文库;人胚肾细胞系HEK293由中国医学科学院基础所细胞中心提供。方法:首先从人胎脑cDNA文库中得到MCHR1和MCHR2的全长cDNA,并将其克隆到pcDNA3.1载体中,构建人MCHR1,MCHR2基因的表达质粒,继而转染人胚肾293,通过G418筛选建立了稳定的表达人MCHR1和MCHR2的细胞株;进一步通过人MCHR的内源激动剂MCH及人MCHR1的特异性激动剂HD-01和拮抗剂ATC0175来检测细胞株的功能和稳定性。主要观察指标:通过对钙离子敏感的荧光指示剂Fluo-3,检测细胞内部反映钙离子浓度变化的荧光值,通过荧光值计算出反映受体活性的半数有效浓度EC50和半数抑制浓度IC50值,以及反映系统可靠性的Z因子。结果:实验建立了稳定表达MCHR1,MCHR2的高通量药物筛选细胞模型,对所建立细胞模型的功能、稳定性、特异性、高通量等特点进行检测。MCHR1细胞模型对MCH的EC50值为17.72nmol/L,对起特异性激动剂HD-01和拮抗剂ATC0175的EC50和IC50分别为37.42nmol/L和13.6nmol/L。而MCHR2细胞模型对MCH的EC50值为3nmol/L,对HD-01和ATC0175则没有反应,MCHR1和MCHR2细胞模型的第1代和25代对激动剂和拮抗剂的反应是基本一样的。MCHR1和MCHR2细胞模型的Z因子为0.61和0.73,并对筛选条件进行了优化,确定了实验系统中细胞的数量为3×104个/孔和二甲基亚砜的终浓度为不超过10g/L系统最佳。结论:采用钙流测定方法可成功建立稳定的MCHR1和MCHR2筛选细胞株及可靠的筛选方法,该细胞模型可同时用于人MCHR激动剂与拮抗剂的筛选。

颞叶癫痫差异发作频率相关生物通路及蛋白-蛋白相互作用网络分析

目的通过颞叶癫痫差异发作频率转录组测序数据的分析,寻找与颞叶癫痫差异发作频率有关的关键功能基因及分子学机制。方法﹐从CEO数据库下载颞叶癫痫不同发作频率转录组测序数据CSE127871,使用R语言DESeq2包进行差异基因表达分析;使用R语言clusterProfiler包对差异基因进行基因本体论及京都基因和基因组百科全书通路富集分析;使用STRING数据库对差异基因进行蛋白质相互作用网络分析;使用Cytoscape软件从蛋白质层面筛选关键基因。结果―通过转录组数据进行差异基因表达分析,总共有820个差异表达,其中上调基因332个,下调基因488个;差异表达基因基因本体论生物学过程显著富集在膜电位调节、化学性突触及离子跨膜转导调控、神经递质水平调节等;差异基因基因本体论细胞组分显著富集在突触、神经胞体、跨膜转导复合体等;基因本体论分子学功能显著富集在跨膜转导正向激活、离子通道及门控通道激活等;京都基因和基因组百科全书通路分析显著富集在神经激活配体-受体作用、胆碱能突触、NF-kappaB信号通路等。通过蛋白质互相作用网络分析及枢纽基因筛选,其中ADCY1,MCHR1,CXCL8、CXCL1、CXCL2、CXCL3基因为重要的枢纽基因。结论颞叶癫痫差异发作频率转录组差异表达基因分子学机制主要与突触结构内化学性及离子通道活动改变相关,ADCY1、MCHR1、CXCL8、CXCL1、cxCL2,CXCL3等基因为不同发作频率颞叶癫搁关键的枢纽基因。