人MCL1基因表达载体的构建及在293细胞中的表达

目的构建含有人髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,MCL1)和绿色荧光蛋白基因(pEGFP)的真核共表达载体,为聋病的基因治疗奠定实验基础。方法应用基因重组技术和限制性内切酶酶切,及基因测序方法,构建并鉴定pEGFP-MCL1真核表达质粒。经脂质体介导转染293细胞系,荧光显微镜下观察pEGFP-MCL1真核表达质粒在293细胞系中的表达,利用逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测MCL1mRNA的表达,Western Blot(蛋白质印迹)方法检测MCL1蛋白的表达。结果阳性重组子经酶切鉴定含有MCL1基因片段,基因测序结果与GenBank中MCL1序列相同。重组pEGFP-MCL1真核表达质粒转入293细胞系后24小时,荧光显微镜下可见绿色荧光表达,RT-PCR能够扩增出MCL1的条带,Western Blot检测出40kDa大小的蛋白。结论成功地构建了含有人全长MCL1基因和pEGFP基因的真核共表达载体,且能在哺乳动物293细胞系中表达。

MCL-1基因研究新进展

MCL - 1基因是 BCL - 2基因家族成员之一 ,在多种肿瘤组织及细胞系中高表达 。

胶质瘤细胞中上皮剪接调控蛋白1(ESRP1)对人髓细胞白血病基因(MCL1)剪接的调控

目的研究胶质瘤细胞系U251中上皮剪接调控蛋白1(ESRP1)对人髓细胞白血病基因1(MCL1)转录本剪接的调控作用。方法对胶质瘤患者数据库中MCL1的测序结果进行数据挖掘,寻找关键位点。构建pc DNA-ESRP1外源表达载体并在U251细胞中进行过表达,通过反转录PCR和Western blot法检测MCL1不同异构体的表达情况。结果 ESRP1在U251细胞中的蛋白表达水平较正常胶质细胞低,MCL1异构体1在U251细胞中的表达高于正常胶质细胞,而异构体2和异构体3的表达则低于正常胶质细胞;在U251细胞中过表达ESRP1以后,发现异构体1表达较未转染组下降,而异构体3表达则显著升高,异构体2表达无明显变化。此外,第801G、802A缺失的MCL1无法被ESRP1正确剪切,异构体1和异构体3的表达与ESRP1转染前后无显著差异。结论抑制ESRP1表达或RNA识别位点突变可以引起肿瘤中癌基因转录本剪接异常。

CircSMC3调节miR-582-5p/MCL1轴对胃癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的:探讨环状非编码RNA(CircRNA)SMC3通过调节微小RNA(miR)-582-5p/髓细胞白血病基因1(MCL1)轴对胃癌(GC)细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法:qRT-PCR检测4种GC细胞系及正常胃上皮细胞系GES-1中SMC3、miR-582-5p、MCL1mRNA的表达水平。将SGC-7901细胞分为对照组、si-NC组、si-SMC3组、mimics NC组、miR-582-5p组、si-SMC3+inhibitor NC组、si-SMC3+miR-582-5p inhibitor组、miR-582-5p+pcDNA3.1组、miR-582-5p+MCL1组。检测各细胞凋亡、增殖、迁移及相关蛋白表达的情况;验证miR-582-5p与SMC3、MCL1的靶向关系。结果:4种GC细胞系中SMC3、MCL1 mRNA表达均增加,miR-582-5p表达下降(P<0.05)。干扰SMC3、过表达miR-582-5p可以抑制SGC-7901细胞增殖、迁移及相关蛋白、表达(P<0.05);抑制miR-582-5p表达可逆转干扰SMC3对细胞的作用(P<0.05);上调MCL1可逆转过表达miR-582-5p细胞的作用(P<0.05)。结论:干扰SMC3可能通过调节miR-582-5p/MCL1轴,抑制SGC-7901细胞增殖、迁移,促进凋亡。

MCL1蛋白在胃癌中的表达及临床意义

目的:MCL1(myeloid cell leukemia-1)与多种恶性肿瘤的发生、发展及转移相关。本文从临床样本和细胞水平检测胃癌组织中MCL1蛋白的表达水平,探讨MCL1蛋白在胃癌发生、发展中的作用。方法:采用S-P免疫组化法检测正常胃黏膜、癌旁胃黏膜和胃癌组织芯片中MCL1蛋白的表达,Western blot检测MCL1蛋白在人胃癌BGC823、SGC7901、MKN28细胞中的表达。结果:免疫组化结果显示,MCL1蛋白表达定位于细胞的胞浆,着色呈黄色至棕黄色;正常胃黏膜、癌旁胃黏膜、胃癌中MCL1蛋白阳性表达率分别为18.18%(4/22)、54.17%(26/48)、83.33%(75/90);MCL1蛋白在胃癌中的表达高于癌旁胃黏膜及正常胃粘膜,癌旁胃黏膜与正常胃粘膜MCL1蛋白表达亦具有明显差异(P<0.05);MCL1蛋白阳性表达率在伴淋巴结转移组为93.48%(43/46),无淋巴结转移组为72.72%(32/44),两者差异有显著性意义(P<0.05);而与性别、年龄和肿瘤大小无关。S-P免疫组化法与Western blot结果显示MCL1蛋白表达与胃癌分化程度呈负相关。结论:MCL1蛋白表达与胃癌发生、分化程度和淋巴结转移相关。

MCL1在鼻咽癌中的表达水平及临床意义

目的研究髓样细胞白血病蛋白1(myeloid cell leukemia-1 protein,MCL1)在鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞中的表达情况,并分析其表达水平与鼻咽癌患者临床预后指标之间的关系。方法运用免疫组化方法检测鼻咽癌组织和正常鼻腔黏膜组织中MCL1蛋白的表达差异,并分析MCL1表达与鼻咽癌患者临床病理指标之间的关系;运用Western blot法检测人鼻咽癌细胞系CNE2、CNE1以及人永生化鼻黏膜上皮细胞NP-69中MUC1蛋白表达情况。结果免疫组化结果显示,鼻咽癌组织中MCL1表达阳性率为58.3%(35/60),在正常鼻腔黏膜组织中MCL1阳性表达率23.8%(5/21),鼻咽癌组织的MCL1表达水平显著高于正常鼻腔黏膜组织(P<0.05);MCL1的表达水平与鼻咽癌患者的T分级、临床分期及淋巴结转移显著相关(P<0.05),而与患者年龄、性别及分化程度无显著相关性(P>0.05);同时,MCL1在鼻咽癌细胞系CNE2及CNE1中的表达高于NP69细胞,差异均有统计学意义(P<0.05);结论 MCL1在鼻咽癌中可能起到促进肿瘤进展的作用,患者的MCL1表达水平可能与其预后相关。

miR-125b靶向MCL1抑制胃癌MGC-803细胞增殖

探讨mi R-125b对胃癌MGC-803细胞增殖的影响及机制,为阐明胃癌发病的分子机制提供实验依据.采用q RT-PCR和原位杂交,检测mi R-125b在正常胃黏膜(NGM)和胃癌(GAC)组织中的表达.将mi R-125b导入胃癌MGC-803细胞,观察mi R-125b高表达对MGC-803细胞增殖的影响.利用Targetscan 6.2软件及荧光素酶报告基因检测,分析mi R-125b对MCL1基因的靶向性作用.构建MCL1干扰载体,观察干扰MCL1基因表达对MGC-803细胞增殖的影响.结果发现,mi R-125b在胃癌组织中低表达,其表达与胃癌的分化程度及患者预后呈正相关,与TNM分期、淋巴结转移呈负相关(P<0.01).mi R-125b高表达后MGC-803细胞的增殖降低、凋亡率增加、裂解caspase-3与裂解PARP表达增加(P<0.01);mi R-125b与MCL1基因的3′UTR(2 613~2 620)结合,抑制MCL1的m RNA及蛋白质表达(P<0.01);沉默MCL1基因表达后MGC-803细胞的增殖降低、凋亡率增加、裂解caspase-3与裂解PARP表达增加(P<0.01).从而得出结论,mi R-125b在胃癌组织中低表达,其表达与胃癌组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移及患者预后密切相关;mi R-125b靶向抑制MCL1基因表达,活化caspase-3信号通路,抑制MGC-803细胞增殖.

USP9X与MCL-1在鼻咽癌中表达及预后分析

目的探讨X染色体连锁的泛素特异肽酶9(USP9X)与髓细胞白血病基因(MCL)-1在鼻咽癌中的表达及其与鼻咽癌预后的相关性。方法选取鼻咽癌患者100例,提取其癌变组织作为观察组,再提取100份健康体检人群的鼻咽组织作为对照组,采用免疫组化Envision法检测两组USP9X与MCL-1的表达情况。观察不同的肿瘤分期、蔓延程度及有无淋巴结转移鼻咽癌患者USP9X与MCL-1的表达情况。对USP9X与MCL-1阳性的鼻咽癌患者进行放化疗,并提取其癌细胞进行细胞培养,采用Western印迹进行蛋白定量分析,观察USP9X与MCL-1阳性的鼻咽癌患者放化疗前后USP9X与MCL-1的表达情况。结果观察组USP9X阳性的患者有72例,对照组仅有2例,两组差异有统计学意义(χ^(2)=6.937,P=0.001);观察组MCL-1阳性的患者有75例,对照组仅有1例,两组差异有统计学意义(χ^(2)=7.634,P=0.001);USP9X及MCL-1与肿瘤分期、蔓延程度及淋巴转移有关,且病情越重,USP9X与MCL-1表达越明显(P<0.05);USP9X与MCL-1阳性的鼻咽癌患者放化疗后表达明显下降(P<0.05),放化疗后蛋白表达量也明显下降(P<0.05)。结论USP9X与MCL-1在鼻咽癌中呈高表达,且在放化疗后表达显著降低,可作为临床评价鼻咽癌预后的诊断标准之一。

miR-125b对结肠癌SW480细胞侵袭潜能影响及机制探讨

目的结肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,microRNA与其发生发展密切相关,且在结肠癌中的作用机制仍不清楚。本研究旨在探讨miR-125b对结肠癌SW480细胞侵袭的影响及机制,为阐明结肠癌发病机制提供理论依据。方法将miR-125b导入结肠癌SW480细胞,观察miR-125b高表达对SW480细胞侵袭的影响。Targetscan 6.2及荧光素酶报告基因进行miR-125b对MCL1基因的靶向性分析;构建MCL1干扰载体,观察干扰MCL1表达对SW480细胞侵袭的影响。结果 miR-125b在SW480细胞中高表达后,细胞的侵袭率降低(miR-125bvs miR-ctr为85±12 vs 214±36;t=21.254,P=0.005 4),细胞凋亡率增加,而Cleaved Caspase-3与Cleaved PARP蛋白质表达增加;miR-125b与MCL1基因启动子区域3′UTR的2 613~2 620位核苷酸位点结合;miR-125b在SW480细胞中高表达后MCL1蛋白表达降低;MCL1低表达后SW480细胞侵袭率降低(si-MCL1 vs si-ctr为108±16 vs 225±42;t=19.542,P=0.006 8),细胞凋亡率增加,而Cleaved Caspase-3与Cleaved PARP蛋白质的表达增加。结论 miR-125b通过靶向抑制SW480细胞中MCL1基因表达,激活Caspase-3信号转导通路,使SW480细胞侵袭能力降低。