MCPH1基因变异致原发性小头畸形患儿的表型及遗传学分析

目的对1例原发性小头畸形患儿进行临床分析和基因检测,以明确致病原因。方法对1例原发性小头畸形患儿的临床资料进行回顾性分析。采用下一代测序(NGS)技术对患儿进行全外显子基因检测,对变异位点采用Sanger测序法进行验证。对变异位点进行生物信息学分析。结果患儿主要的临床表现为小头畸形、下颌稍小、高腭弓、眼眦稍上斜、运动及认知发育落后。基因结果显示,患儿MCPH1基因存在第6外显子c.445G>A(Val149Lle)及第13外显子c.2312C>G(Pro771Arg)复合杂合变异。患儿父亲携带MCPH1基因c.445G>A杂合变异,母亲携带MCPH1基因c.2312C>G杂合变异,姐姐未检测到该变异。HGMD Pro、PubMed和ClinVar数据库无关于MCPH1基因c.445G>A和c.2312C>G变异的报道。ExAC数据库和千人基因组数据库中未收录MCPH1基因c.445G>A变异和c.2312C>G变异。Polyphen2、SIFT、Mutation Taster在线软件预测MCPH1基因c.445G>A变异为良性(BH4),MCPH1基因c.2312C>G变异为有害。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)指南评估2个变异均为可能致病的变异。结论患儿临床表型高度符合小头畸形的诊断,但基因检测致病证据不充分。因此除MCPH1基因(8p23.1)区域突变外,可能还存在影响功能内含子区域的突变。

利用生物信息学方法挑选MCPH1基因标签单核苷酸多态性(tag-SNPs)位点

目的:为考察汉族人群MCPH1基因与原发性小头畸形病的关系,利用生物信息学方法挑选汉族人群中的MCPH1基因标签单核苷酸多态性(tag-SNPs)位点。方法:利用NCBI数据库,确定MCPHl基因研究范围:利用Hapmap数据库获取汉族人群的MCPHl基因SNPs数据;应用Haploview4.2对MCPH1基因进行连锁不平衡分析;在D′值95%可信区间内构建单倍域(haplotype block):根据单倍域内SNPs之间的r2值和LOD值,挑选标签SNP。结果:在汉族人群中,MCPH1全基因范围内共构建35个单倍域,挑选出122个标签SNPs,确定了各个单倍域内的代表单倍型。结论:汉族人群MCPH1基因的122个SNPs位点是较具代表性的标志性位点,可被选为标签SNPs,并作为汉族人群MCPHl基因与原发性小头畸形病的关联研究。

用pLNCX2携带人MCPH1基因shRNA重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌Caski细胞中对MCPH1表达的影响。方法将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pLNCX2中，构建携带人MCPHI基因RNA干扰的逆转录病毒载体pLNCX2-shRNA—MCPH1，经PT67细胞包装后，产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株Caski细胞，并用G418筛选产生稳定的细胞克隆，用RT—PCR和Western印迹检测细胞中MCPH1mRNA和蛋白表达的变化。结果重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确，逆转录病毒感染Caski细胞后用G418筛选出稳定的细胞克隆，RT—PCR和Western印迹检测人MCPH1mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论携带人MCPHI基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染Caski细胞后能明显抑制MCPHImRNA和蛋白表达，为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。

稳定表达人MCPH1基因shRNA的宫颈癌Caski细胞系的建立

目的建立稳定表达人MCPH1基因shRNA的宫颈癌Caski细胞系,并观察shRNA对Caski细胞中MCPH1基因表达的影响。方法将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSUPERRetro中,构建携带人MCPH1基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER-shRNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生重组逆转录病毒,感染宫颈癌细胞株Caski,经puromycin筛选稳定的细胞克隆,实时荧光定量PCR和Westernblot法检测细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确;逆转录病毒感染Caski细胞后可筛选出稳定的细胞克隆;pSUPER-shRNA-MCPH1组细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平明显低于阴性对照组及正常对照组。结论已成功建立了稳定表达人MCPH1基因shRNA的Caski细胞系,shRNA能明显抑制MCPH1基因的表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。

小脑症1基因过表达对人肺癌细胞A549凋亡的影响

目的探讨小脑症1(microcephalin 1,MCPH1)基因过表达对人肺癌细胞A549凋亡的影响。方法将质粒pcDNA3.1(-)/MCPH1转染肺癌细胞株A549,并设阴性对照组[pcDNA3.1(-)质粒转染]和未转染组。转染48 h后,采用qRT-PCR法检测各组细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平;转染72 h后,Western blot法检测各组细胞中MCPH1蛋白的表达水平,流式细胞术分析细胞的凋亡情况。结果质粒pcDNA3.1(-)/MCPH1转染A549细胞后,均可明显上调细胞中MCPH1基因mRNA和蛋白的表达,与阴性对照组和未转染组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);质粒pcDNA3.1(-)/MCPH1转染组细胞凋亡率[(16.82±1.29)%]较阴性对照组[(6.27±0.88)%]和未转染组[(5.36±0.43)%]明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 MCPH1过表达后可明显促进A549细胞的凋亡,为进一步研究MCPH1基因在肺癌细胞凋亡中的作用及其机制奠定了基础。